MiRNAs与EGFR-TKIs继发性耐药机制的研究进展

王明 孙震宇 黄礼年

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率位于恶性肿瘤的首位。目前约仅有30%的患者获得早期诊断，并获得手术治疗，对于失去手术机会的晚期患者5年生存率小于15%[1]。肺癌包括分为两种类型：非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）和小细胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC），两者各占比例分别约为87%和13%。目前含铂双药化疗方案仍是晚期NSCLC推荐的一线方案，但随着对NSCLC发生、发展分子机制的了解，目前已有一些靶向药物[如表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）]应用于临床，并获得不错的临床收益。

EGFR是由N-端胞外的配体结合区域、疏水的跨膜区域、细胞内的催化区域（含酪氨酸激酶活性）组成[2]。EGF结合EGFR形成异二聚体，激活并磷酸化胞内酪氨酸激酶，继而激活一系列下游信号通路，如JAK-STAT、Ras-Raf-MAPK、PI3K-Akt-mTOR，参与细胞增殖、分化的调节。而EGFR信号通路的异常调节可引起肿瘤的发生、增殖、侵袭和转移，目前靶向该通路的有单克隆抗体（cetuximab、panitumumab）和激酶抑制剂（gefitinib、erlotinib、afatinib），这些药物毒副反应较轻，明显改善了NSCLC患者的生存质量和生存期。但NSCLC患者中只有部分伴有EGFR突变阳性的患者受益，且这些药物最终还可产生继发性耐药，出现病情进展。目前，EGFR突变作为评估TKIs药物有效性的生物学标志，但实际临床样本EGFR突变检测存在一定的技术难题，PCR技术的检测假阳性率较高，而作为金标准的EGFR测序阳性率较低。

目前研究发现的EGFR-TKIs继发性耐药机制有：①细胞内EGFR基因受体结合区突变（T790M）：增强了催化区域与ATP的结合能力，抑制了其与TKIs的结合；②Met基因扩增：通过激活不依赖 EGFR的ERBB3的磷酸化作用以及下游区的PI3K-Akt-mTOR通路；③胰岛素样生长因子1受体（insulin-like growth factor 1 receptor, IGF-1R）的激活：通过激活PI3K/AKT信号通路引起TKIs的耐药；④EGFR扩增7号染色体的缺失；⑤第10号染色体磷酸酶和张力蛋白同源缺失基因（PTEN）基因突变；⑥表型转化：NSCLC转化为SCLC、上皮间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition, EMT）等。针对耐药问题，microRNAs（miRNAs）与EGFR信号通路相关性的研究已成为热点之一。MiRNAs是一类由内源基因编码的长度约22个核苷酸的非编码小分子RNA，参与转录后水平基因的表达调控。MiRNAs几乎参与了所有细胞生物学行为的调控，并在肺癌的发生、发展中发挥重要作用[3]，可起到致癌基因或抑癌基因的作用。MiRNAs有望成为改善EFGR-TKIs耐药的新靶点，为治疗NSCLC开拓新的方向。

1 MiRNAs与EGFR信号通路之间的调节关系

越来越多的试验证实miRNAs与EGFR的表达、EGFR突变状态及信号通路的激活息息相关。Dacic等[4]报道miR-155只在EGFR/KRAS阴性的肺腺癌中高表达，miR-25只在EGFR阳性的腺癌中高表达，miR-495只在KRAS阳性的腺癌中高表达，而let-7g在以上三种类型腺癌中均呈低表达，特别是EGFR/KRAS阴性。

Liu等[5]研究发现miR-133b在NSCLC组织中低表达（P=0.002），miR-133b和EGFR mRNA的表达量呈负相关（r=-0.71,P＜0.001）；将miR-133b转染入PC-9和A549细胞，发现miR-133b可抑制EGFR、AKT、ERK1/2的磷酸化，从而抑制EGFR信号通路，诱导细胞凋亡、抑制细胞侵袭，并增加对EGFR-TKIs的敏感性。Wang等[6]研究表明，miR133a在NSCLC组织及细胞中呈低表达，miR133a通过抑制胰岛素样生长因子受体（insulin-like growth factor receptor, IGF-R）、转化生长因子β-R1（transforming growth factor-β receptor type-1, TGFβ-R1）和EGFR来调节AKT信号通路，最终抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭。MiR133a与总生存期有关，miR133a高表达是预后良好的指标。因此，miR133a不仅可作为判断预后的指标，也是NSCLC未来潜在治疗靶点。

Yoo等[7]研究多种肺癌细胞株（WI-38、A-13、A549、HCC-1588、NCI-H596）及15例肺癌组织，发现miR-9500呈低表达，miR-9500通过抑制AKT1（EGFR信号传导过程中关键受体）来抑制肿瘤的增殖、侵袭和转移。另外，同样作用于AKT，起到抑癌作用的还有miR-153[8]，然而miR-200[9]起着致癌基因功能，AKT抑制剂可用于治疗miR-200依赖性的肺癌患者。

以上试验揭示了miRNAs对EGFR信号通路的调节作用，相反，EGFR异常表达或突变同样可影响miRNAs的表达。MiRNAs和EGFR信号通路之间形成反馈调节，参与肺癌的发生、发展。Guo等[10]研究发现，在EGFR突变型或野生型的肺癌细胞株（H1975、H1650、A549及H292）中miR-145表达下调，且miR-145和p-EGFR呈负相关关系（P＜0.05），EGFR信号通路的激活可引起miR-145的表达下调；应用EGFR抑制剂AG1478作用于H1975细胞（EGFR突变型）、A549细胞（EGFR野生型）、正常细胞株BEAS-2B，可逆转EGFR信号通路对miR-145的负性调节。

2 MiRNAs与EGFR-TKIs继发性耐药的关系

对EGFR信号通路的深入研究促进了EGFR-TKIs的发展，目前应用于临床的有gefitinib、erlotinib和afatinib。但因为继发性耐药，使EGFR-TKIs临床受益受限，其中70%是由于EGFR基因二次突变（T790M、c-MET扩增）。

2.1 MiRNAs与EMT EMT发生过程中，上皮特异性标志物（E-钙粘蛋白等）表达下调，间质特异性标志物（波形蛋白等）表达上升，使上皮细胞失去细胞极性及与基膜连接的功能，获得细胞运动性、细胞迁移和侵袭等相关的间质功能，使上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力，甚至参与EGFR-TKIs耐药等重要生物学过程。

近年来研究发现，miRNAs在EMT过程中充当关键调节者，且不同的miRNAs通过不同的靶点调控EMT的发生。Xia等[11]研究发现，在NSCLC组织中，miR-638表达明显下调，miR-638的表达下调可致E-钙粘蛋白的减少，纤粘蛋白、波形蛋白和Snail的上升，而将携带有miR-638的质粒转入NSCLC细胞系，发现E-钙粘蛋白上升，纤粘蛋白、波形蛋白、Snail降低。因此，miR-638的表达下调可通过诱导EMT参与NSCLC的增殖和侵袭。Seol等[12]研究发现，在NSCLC组织及细胞中，miR-373表达下调，将携带有pre-miR-373的质粒转染入A549和Calu-6细胞，波形蛋白、N-钙粘蛋白、纤粘蛋白表达下调，IRAK2和LAMP1表达下调；将靶向IRAK2和LAMP1的siRNAs转染入上述两种细胞，间质标志物同样出现表达下调，两种细胞的侵袭、转移明显受到抑制。因此，miR-373可通过靶向IRAK2和LAMP1抑制EMT，miR-373/IRAK2/LAMP1轴可成为NSCLC新的治疗靶点。Suh等[13]研究发现，在NSCLC中，miR-30c表达下调，波形蛋白、纤粘蛋白水平升高和E-钙粘蛋白水平下调，miR-30c可以通过靶向波形蛋白、纤粘蛋白调控TGF-β诱导的EMT，此外，还可通过靶向MTDH和HMGA2抑制NSCLC的转移。因此，miR-30c的表达水平可能作为NSCLC转移的标志物，增加miR-30c的表达可能有助于延缓病情进展、抑制肿瘤转移。miR-30c与EMT的发生关系同样也得到其他学者的证实[14]。Li等[15]研究发现，在NSCLC中mi-R-148a呈低表达，ROCK1呈高表达；将携带有miR-148a的质粒转染入H1299细胞，发现ROCK1表达下调，E-钙粘蛋白水平升高，波形蛋白水平下降，细胞的侵袭性减弱；而si-ROCK1的使用同样会引起上述上皮、间质标志物的改变，即提示了miR-148a可通过调节ROCK1的表达抑制EMT的发生，抑制NSCLC的侵袭、转移。同样，在NSCLC中低表达，表现为抑癌基因功能，抑制肿瘤增殖、侵袭、转移的还有miR-145、miR-135a、miR-132、miR-33a、miR-125b、miR-146a。miR-145通过靶向Oct4参与调节EMT的发生[16]；miR-135a通过靶向KLF8调节EMT[17]；miR-132通过靶向ZEB2抑制EMT的发生[18]；miR-33a通过靶向Twist1调节EMT的发生[19]；miR-125b在紫杉醇耐药的NSCLC细胞株A549、H460中呈低表达，可通过靶向Sema4C调节EMT的发生[20]；miR-146a不仅可以通过靶向胰岛素受体底物-2（insulin receptor substrate 2, IRS-2）抑制EMT的发生，还能使EGFR-TKIs耐药的NSCLC患者恢复对gefitinib的敏感性[21]。

而某些miRNAs在NSCLC中表现为致癌基因，能诱导EMT的发生，促进肿瘤的转移和侵袭，导致其对EGFR-TKIs的耐药。Cao等[22]研究发现，在NSCLC细胞株（A549、LC-2/ad、ABC1、PC1、SQ5）中，miR-23a和Smad2/3表达上调。将TGF-β1刺激A549细胞，导致miR-23a表达明显升高，E-钙粘蛋白表达下调，N-钙粘蛋白表达上调。将siRNAs干扰Smad2/3的表达，可引起miR-23a表达下调，TGF-β1/Smad信号通路可调节miR-23a的表达。将miR-23a抑制剂转染入A549细胞中，随后再用TGF-β1刺激该细胞，发现E-钙粘蛋白仍可表达，而N-钙粘蛋白表达微弱，miR-23a抑制剂可部分抑制TGF-β诱导的EMT。将Pre-miR-23a转染入A549细胞中，引起E-钙粘蛋白的下调、波形蛋白的上调。因此，miR-23a可通过靶向E-钙黏蛋白（cadherin）基因（CDH1基因）调节TGF-β1诱导的EMT，导致对gefitinib的耐药。Xu等[23]研究发现，在过表达 hsamiR-191的人气道上皮细胞中，E-钙粘蛋白表达下调，N-钙粘蛋白、波形蛋白表达上调。将miR-191抑制剂转染入人气道上皮细胞中，发现N-钙粘蛋白、波形蛋白的表达下调，E-钙粘蛋白的表达上调，抑制EMT的发生。

增加抑癌基因型miRNAs和减少致癌基因型miRNAs的表达或许可成为NSCLC治疗的新靶点，起到抑制肿瘤侵袭和转移、增加对EGFR-TKIs敏感性的作用。

2.2 MiRNAs与PTEN基因缺失 研究发现，PTEN基因缺失可导致EGFR-TKIs继发性耐药的产生。Shen等[24]发现，NSCLC组织中miR-21呈高表达（78.7%, 37/47），PTEN蛋白呈低表达（72.3%, 34/47），miR-21的表达与PTEN呈负相关；46例NSCLC患者在用TKI（gefitinib或erlotinib）治疗后，相对疾病稳定（stable disease, SD）组和部分缓解（partial response, PR）组，疾病进展（progressive disease, PD）组miR-21升高，PTEN降低；相对PC9细胞（gefitinib敏感），PC9/GR细胞（gefitinib耐药）的miR-21表达约为3.70倍，PTEN基因缺失，AKT和ERK均呈激活状态；先将miR-21转染入PC9细胞，发现其对gefitinib的敏感性降低，再将PTEN转染入PC9细胞，发现PTEN可恢复细胞对gefitinib的敏感性；将miR-21抑制剂转染入PC9/GR细胞，发现可恢复细胞对gefitinib的敏感性。因此，抑制miR-21的表达可能会逆转EGFR-TKIs耐药。关于miR-21与PTEN之间的调控关系分别在肺鳞癌、腺癌中也得到证实[25,26]。Wang等[27]研究发现，miR-29b在NSCLC组织中表达下调，将携带有miR-29b慢病毒转染入A549细胞中，MMP2、PTEN mRNA表达下调，细胞的增殖、侵袭、转移能力减弱。携带有miR-29b抑制剂的慢病毒转染入H460细胞，MMP2、PTEN mRNA表达上调，细胞的增殖、侵袭、转移能力增强。因此，miR-29b通过直接靶向MMP2和PTEN抑制NSCLC的侵袭和转移，miR-29b可作为延缓NSCLC转移、改善EGFR-TKIs耐药的治疗靶点。MiRNA-10a在NSCLC组织中明显高表达，在高转移及低转移特性的NSCLC细胞（H1299、SPC-A-1sci、SPC-A-1、H358）中，miRNA-10a与PTEN的表达呈反比关系，miR-10a通过PTEN/AKT/ERK信号通路促进肿瘤的侵袭[28]。

2.3 MiRNAs与c-Met基因扩增 在NSCLC治疗过程中，miRNAs可通过调节c-Met基因，参与EGFR-TKIs继发性耐药。Zhou等[29]研究发现，miR-34a可能通过调控Met基因，克服EGFR-TKIs耐药。在HCC827、PC-9细胞（EGFR基因19号外显子缺少）中miR-34a高表达，Met低表达；用HGF诱导产生gefitinib耐药细胞株（HCC827/GR、PC-9/GR），发现其中miR-34a低表达，Met高表达；将miR-34a转染入HCC827/GR、PC-9/GR细胞，发现Met mRNA和蛋白水平下调；miR-34a单一治疗能减少Met的表达，但不能抑制EGFR的磷酸化及下游信号通路（PI3K/Akt信号通路）的激活，因而诱导HCC827/GR、PC-9/GR细胞凋亡的效果不佳；而miR-34a联合gefitinib治疗可抑制90%以上的Met磷酸化，导致下游的Akt和ERK1/2磷酸化受到影响，可诱导HCC827/GR细胞的大量凋亡。Zhou等[30]发现miR-130a在Pc9细胞（gefitinib敏感）中高表达，而Met低表达；将miR-130a转染入Pc9 GR细胞（gefitinib耐药），发现Met蛋白表达下调；miR-130a可通过靶向Met逆转gefitinib耐药，增强gefitinib诱导的肿瘤细胞凋亡。

靶向MET、起抑癌基因功能的还有miR-409-3p、miR-206、miR-200a。MiR-409-3p[31]在肺腺癌组织中低表达，可通过靶向Met抑制Akt信号通路，从而抑制肿瘤的增殖、侵袭。MiR-409-3p与pTNM分期、淋巴结转移有关，是判断预后的独立的指标。在NSCLC组织中，MiR-206[32]低表达，MET的3´UTR的484-508、796-823以及BCL2的 3´UTR的24034-4057是miR-206的直接靶点，从而诱导肿瘤细胞的凋亡。MiR-200a[33]在NSCLC中低表达，可通过靶向EGFR和c-Met抑制肿瘤的侵袭和转移，提高耐药细胞株对gefitinib的敏感性。这意味着，miR-200a作为治疗靶点，可适用于EGFR-TKIs耐药的NSCLC患者。

3 MiRNAs评估EGFR-TKIs的有效性

越来越多的研究发现miRNAs可作为评估EGFR-TKIs有效性的标志物。Li等[34]研究发现在原发性TKIs耐药的NSCLC细胞株（A549、H1299、H23、H460、H1975）中，miR-200c呈低表达，150例NSCLC患者（73例EGFR突变型、66例EGFR野生型、11例未知）接受gefitinib治疗，客观缓解率（objective response rate, ORR）为34.7%，疾病控制率（disease control rate, DCR）为64.7%；其中伴有miR-200c高表达的EGFR野生型患者的临床受益明显优于低表达者，DCR（57.7%vs27.5%,P=0.014），无疾病进展生存期（progression-free survival, PFS）（5.0个月vs1.2 个月，P=0.001），总生存期（overall survival, OS）（9.6个月vs5.0个月，P=0.037），但在EGFR突变型患者miR-200c的表达对患者的PFS、OS、ORR无明显影响。因此，miR-200c可能用于判断EGFR野生型的NSCLC患者对EGFR-TKIs敏感性的指标。Shen等[35]研究了201例伴有EGFR突变型的NSCLC患者服用gefitinib的情况，发现其中miR-21低表达的患者OS明显改善（28.3个月vs24.4个月，P=0.004,5），但miR-21高表达的患者表现出对gefitinib更好的反应率（73.7%vs30.7%,P＜0.001），miR-21可作为评估gefitinib敏感性的独立标志物。EGFR负性调节因子Mig6是miR-200的靶点，体内试验证实该Mig6/miR200的比值与erlotinib敏感性成反比关系。因此，Mig6/miR200可作为评估EGFR-TKIs敏感性的可信赖指标[36]。

4 讨论与展望

与传统的化疗相比，肺癌的靶向药物治疗具有方便、毒副作用轻的优点，但后期会出现耐药问题。MiRNAs是基因表达的调控者，通过精密、复杂的信号传导网络调控人类的生命活动。因此miRNAs异常可引起肿瘤耐药相关通路中基因表达水平的改变，从而导致耐药。目前针对miRNAs与EGFR信号通路之间调控关系的研究已取得部分成果，促进了miRNAs在肺癌的治疗进展，如let-7和miR-34联合治疗可协同增加NSCLC对erlotinib的敏感性[37]。相信随着miRNAs与肺癌耐药机制研究的进一步加深，miRNAs必然能为肺癌的诊断及治疗带来更为光明的前景!