色谱法在饲料柠檬酸检测中的应用

2015-01-24林仙军罗成江张航俊浙江省兽药饲料监察所浙江杭州310020

浙江畜牧兽医 2015年5期

林仙军，罗成江，王侃，张航俊(浙江省兽药饲料监察所，浙江杭州310020)

专题论述

色谱法在饲料柠檬酸检测中的应用

林仙军，罗成江，王侃，张航俊
(浙江省兽药饲料监察所，浙江杭州310020)

柠檬酸是有机酸中的第一大酸，又名拘橼酸，分子式C6H8O7H2O，安全无毒，能被生物体直接代谢吸收［1］，作为饲料添加剂可提高饲料的适口性［2］，降低pH值，激活机体肠胃内的消化酶，提高饲料转化率，增强机体抗病力［3］，还可作为防霉剂和抗氧化剂保证饲料品质［4］。

本文主要对饲料中柠檬酸的检测方法作一简要综述，供参考。

1 高效液相色谱法(HPLC)

HPLC法是目前应用最多的色谱分析方法，由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器等组成，具有速度快、分辨率及灵敏度高、色谱柱可反复使用、样品量少且易回收等优点［5］，利用HPLC法对饲料中的柠檬酸进行测定，可以避免色素和杂质影响，测定方法简便，快速准确。

索德成等(2012)［6］利用HPLC法同时测定饲用酸化剂中甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、柠檬酸含量。采用Grom-Sil org acid柱(250 mm×2.1 mm，5μm)分析。流动相为pH值2.5磷酸水溶液;流速1.0 mL/min;检测波长210 nm;柱温30℃。在该色谱条件下，5种有机酸分离良好。平均回收率均大于85%，RSD小于10.0%。检测结果表明该法操作简便易行，准确可靠。郑婷等(2009)［7］建立了测定饲料添加剂中主要有机酸-甲酸、乳酸、柠檬酸含量的HPLC分析法。色谱条件为Agilent ZORBAX SB-AQ 5μm(4.6 mm×250 mm)分析柱，流动相为0.1 mol/L磷酸二氢钠缓冲溶液(pH=2)∶乙腈=98∶2，流速0.8 mL/min，柱温25℃，检测波长210 nm，在200～4000 mg/L浓度范围内，线性关系良好，加标回收率98%～104%。谢明等(2004)［8］应用反相液相色谱法同时分析测定饲料有机酸化剂中乙酸和柠檬酸的化学含量。结果表明，柠檬酸变异系数不超过3%，回收率92%～96%，测定具有较高的准确性和精确度。

HPLC法分析速度较快、灵敏度较高，但样品预处理操作比较繁琐，测定周期较长、成本较高、测定后需清除残留样品，若能与其他技术联用，缩短检测周期、降低测定成本，则在检测饲料柠檬酸中将有更大进展。

2 离子色谱法(IC)

IC法是一种分析柠檬酸的有效方法，可按分离原理分为离子交换色谱法(IEC)和离子排斥色谱法(ICE)。IEC法的原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离［5］。

该法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸，在分离低分子有机酸方面，无需对样品进行复杂的预处理，能很好分离和同时检测多种有机酸，是分析低相对分子质量有机酸的有效方法。ICE法分析有机酸主要有以下优点:一是适合于含水基体;二是对强亲水性物质不会造成损失;三是只需简单的样品前处理，不需柱前衍生处理;四是有机酸分析几乎不受无机阴离子干扰。

刘霞等(2009)［9］建立了同时测定饲料添加剂中甲酸、乳酸、柠檬酸及磷酸的IC法。样品采用酸碱结合的预处理方法提取饲料添加剂中的4种有机酸。色谱条件为RFC-30KOH淋洗液发生器、AS11-HC离子色谱柱，抑制电导检测。此法各种有机酸和无机酸线性关系良好(相关系数为0.9995～0.9998)，线性范围为1～20 mg/L，回收率为98%～100%，分析方法快速简便。

虽然IC法已应用于饲料中柠檬酸的测定，但因淋洗液和柱填料的特殊性，对样品中蛋白质含量有严格限定，不适于复杂样品分析，且柱子容量较小，进样量不宜太多。因此，对于含有复杂成分的饲料，不适合用该法检测柠檬酸含量。

3 气相色谱法(GC)

GC法的原理是根据物质的物理性质不同，试样中气相和固定液液相间的分配系数不同，当汽化后的试样被载气带入色谱柱中运行时，组份就在其中的两相间进行反复多次分配，由于固定相对各组份的吸附或溶解度不同，从而达到分离目的。

该法主要适用于气体物质或可在一定温度下转化为气体的物质，GC法与不同检测器的联用，大大提高了其检测灵敏度，其中GC法和质谱法联用(GC-MS)已成为具有高分离能力、高灵敏度、高分析速度和高鉴定能力的分离检测技术，是目前低分子有机酸检测中最常用和最精密的方法。但因不易挥发或热不稳定酸类在进样前需经衍生化反应，导致样品前处理比较困难且费时，成为GC法检测有机酸的瓶颈所在。

黄建立(2005)［10］建立了同时测定饲料添加剂中乳酸、柠檬酸的毛细管GC分析法。样品添加内标酒石酸后，用N，O一双(三甲基硅烷)乙酰胺(BSA)硅烷化，经SE-30毛细管柱色谱分离，氢火焰离子化检测器检测并对实际样品进行分析。乳酸和柠檬酸的回收率分别为97.5%、97.3%。任清(2002)［11］建立了饲料添加剂中富马酸、乳酸、柠檬酸同时测定的毛细管GC分析法。样品添加内标酒石酸后，用N，O-双(三甲基硅烷基)乙酰胺(BSA)硅烷化，经SE-30毛细管柱色谱分离，氢火焰离子化检测器检测。富马酸、乳酸和柠檬酸的回收率分别为97.4%、97.2%和96.8%。

饲料中柠檬酸的测定方法很多，但各有适用范围与优缺点。选择合适的提取分离及分析测定方法，除需考虑所测饲料的结构性质外，还要考虑其成分对柠檬酸的干扰。

目前，色谱法作为基本分析方法，已经成为测定饲料中柠檬酸的主要方法。检测器、色谱柱联用(GC-MS)技术的发展，解决了传统液相检测器灵敏度和选择性不够的缺点，提供了可靠、精确的相对分子质量及结构信息，简化了试验步骤，节省了样品准备时间和分析时间，因此是对饲料生产进行监控的有效检测手段之一。

［1］王浩，王文梅，许丽，等.柠檬酸的营养作用及其在断奶仔猪饲养中的应用［J］.动物营养学报，2012(6):1007 -1012.

［2］伍昭燕.日粮中添加柠檬酸对蛋鸡生产性能的影响［J］.畜牧兽医杂志，2011(1):72-74.

［3］薄涛.酸化剂的作用机理及其所受影响的因素［J］.当代畜禽养殖业，2007(12):12-14.

［4］赵彦青.酸化剂在畜禽生产中的应用研究进展［J］.中国畜禽种业，2012(9):28-29.

［5］杜家菊，赵建飞.食品中柠檬酸检测方法的研究进展［J］.山东理工大学学报(自然科学版)，2009(5):98 -103.

［6］索德成，李兰，樊霞.饲用酸化剂中甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、柠檬酸的同步测定［J］.饲料工业，2012(21):60 -62.

［7］郑婷，蔡玉兴，刘霞，等.高效液相色谱法测定饲料添加剂中有机酸含量［J］.分析试验室，2009(S2):230 -232.

［8］谢明，吴莹莹，侯水生.饲料有机酸化剂中乙酸、柠檬酸的高效液相色谱检测分析［J］.饲料工业，2004(10):48 -49.

［9］刘霞，郑婷，施超欧，等.离子色谱法测定饲料添加剂中有机酸和无机酸含量［J］.中国饲料，2009(8):39-41.

［10］黄建立.饲料添加剂中乳酸和柠檬酸的毛细管气相色谱法测定［J］.福建分析测试，2005(4):2277-2279.