循环游离DNA在乳腺癌中的临床应用

庞达夏冰舒张显玉

·特约综述·

循环游离DNA在乳腺癌中的临床应用

庞达①②夏冰舒①张显玉①

庞达教授，医学博士，博士研究生导师，“龙江学者”特聘教授。现任哈尔滨医科大学副校长、黑龙江省肿瘤生物治疗重点实验室主任、黑龙江省省级重点学科带头人；黑龙江省高校科技创新团队首席专家，获省级“德艺双馨”名医称号，黑龙江省杰出青年科学基金获得者，获得中国医师奖及国家级优秀科技工作者奖励、享受国务院及省政府特殊津贴。担任中国抗癌协会常务理事、乳腺癌专业委员会副主任委员、肿瘤病因学专业委员会常委与黑龙江省抗癌协会乳腺癌专业委员会主任委员；兼任《实用肿瘤学杂志》主编及《中华肿瘤杂志》、《癌变·畸变·突变》、《中国肿瘤临床》、《中国癌症杂志》、《国际免疫学杂志》等期刊编委。主持国家、省级科研项目20余项，国际合作项目1项。发表SCI期刊论文50余篇，影响因子累积150余分，发表国内核心期刊论文近百篇。主编多部医学教材。获省部级科技进步奖4项、中华医学科技奖等多项科研奖励。

循环游离DNA以细胞外游离形式存在于血液中，可由正常细胞和癌细胞释放。乳腺癌患者血液中循环游离DNA水平高于正常人，且循环游离DNA可以反映癌组织的基因突变、甲基化状态、拷贝数改变、杂合子丢失等特征，是乳腺癌诊断、治疗、预后检测中具有巨大潜力的生物学指标。本综述简要介绍了循环游离DNA的生物学特性，并从定量及定性检测两方面对循环游离DNA近年来在乳腺癌中的临床应用进行较全面的阐述。

循环游离DNA 循环肿瘤DNA 肿瘤标记物 乳腺癌

乳腺癌是我国女性中最常见的癌症，且发病率逐年上升，因此寻找更佳的诊断、治疗方法迫在眉睫。近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，循环游离DNA检测在乳腺癌诊疗过程中的应用成为研究热点。以细胞外游离形式存在于血液中的DNA被称为循环游离DNA。因其检测具有无创性、可重复性等特点，也被称为“液体活检”，在乳腺癌的早期诊断、疗效评估、复发转移监控中扮演着重要角色。

1 循环游离DNA的生物学特性

循环游离DNA通常是以蛋白质复合体形式存在的DNA双链片段，大小为180～10 000 bp，从小碎片到大片段差异较大［1］。通常来源于凋亡细胞的DNA片段较小，而来源于坏死细胞更大些。

由于循环游离DNA的片段大小差异较大，因此

其在血液中的半衰期也不尽相同。基于对血液中胎儿来源的血浆循环游离DNA的观察发现，其半衰期为0.25小时至数小时［2］。循环游离DNA在血液中的清除机制尚不完全清楚。目前的研究显示，循环游离DNA的清除过程分为快速清除阶段及缓慢清除阶段［3］。血浆核酸酶被认为是循环游离DNA清除过程中的主要核酸酶，但其对蛋白复合体作用有限，因此蛋白复合体可使循环游离DNA免于降解。在部分癌症患者的血浆中，存在着血浆核酸酶的活性降低，这可能是循环游离DNA浓度升高的原因之一［4］。

在健康人的血浆中，循环游离DNA主要来源于凋亡细胞［5］。除此之外，所有的活细胞都自发性的向血液中释放DNA片段，这些DNA片段又称为代谢性DNA片段。代谢性DNA片段具有实际的生物学功能，如作为转录模板生成RNA，或与糖蛋白结合作为信使等。对于癌症患者而言，循环游离DNA不仅来源于上述途径，也来源于坏死的细胞及上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）过程中脱离入血的播散肿瘤细胞。据估算，在1位肿瘤重约100 g（相当于3×1010个细胞）的患者体内，每天约有3.3%肿瘤来源的DNA被释放入血［6］。

癌组织中通常混杂着不同肿瘤干细胞来源的亚克隆及正常组织细胞。因此，癌组织向血中释放的循环游离DNA既包括了肿瘤来源的DNA，也包括了正常细胞来源的DNA。其中肿瘤来源的循环游离DNA又称为循环肿瘤DNA。对循环游离DNA的深入研究发现，循环肿瘤DNA所占比例与癌组织的大小和状态有关，循环肿瘤DNA可以反映出癌组织DNA的特征［7］。因此，可以借助无创性的循环游离DNA检测，实时监测癌组织的状态，对于循环游离DNA分为定量和定性检测两大类。

2 循环游离DNA的定量检测

癌症患者循环游离DNA含量高于健康人，乳腺癌患者也不例外。由于巨噬细胞自身的清除作用，健康人血中的循环游离DNA含量维持在较低水平［8］。癌症患者癌细胞的坏死及播散所释放的DNA超出了机体的清除能力，因此癌症患者的循环游离DNA维持在较高水平。据报道，健康人血浆中循环游离DNA浓度为3～63 ng/mL，而癌症患者为122～462 ng/mL［9］。有关乳腺癌的研究显示［10］，乳腺癌患者的循环游离DNA水平较健康人高，其中患者的循环游离DNA浓度平均为105.2 ng/mL，健康人为77.06 ng/mL，患者术后循环游离DNA水平明显下降，平均为59.0 ng/mL，而淋巴结转移和/或远处转移的患者循环游离DNA浓度更高。这也提示了循环游离DNA浓度可能与肿瘤负荷相关。对上述研究分析后发现循环游离DNA浓度并不一致，主要原因如下。

2.1初始样本不同

提取外周血循环游离DNA指的是从血浆或血清中提取DNA。血清中循环游离DNA的浓度高于血浆，这是由于血液凝结过程中白细胞破裂释放大量DNA所致［11］。血清中循环游离DNA浓度的升高与癌症患者体内的循环游离DNA浓度升高无关。因此，血浆中提取的循环游离DNA浓度无法与血清中的循环游离DNA相比较，利用血浆中提取的循环游离DNA来研究肿瘤来源的DNA是较好的选择［12］。循环游离DNA浓度也随着血浆和血清的静置时间延长而显著增加［13］，这也对血浆和血清的保存时间提出了要求，样本静置时间不一致可能导致检测结果出现偏差。

2.2提取循环游离DNA的不同方法

针对片段大小不同的DNA提取方法不同，循环游离DNA片段大小本身就存在着较大差异。循环游离DNA不同的提取方法也是导致浓度不一致的原因之一。目前循环游离DNA主流的提取试剂盒对比研究发现，QIAGEN（QIAamp circulating nucleic acid kit）提取效率最高［14］。

2.3检测浓度的不同方法

不同实验室之间的检测方法很难达到一致，绝对定量的实时定量PCR中应用的染料、内参基因均各有不同，最终的结果也可不尽相同。内参基因选择上常用LINE1［15］、EIF2C1［16］等，即使对于同一个基因，应用的引物不同，最终产物片段大小也可能不同，从而导致拷贝数及浓度出现差别。

循环游离DNA的定量检测目前尚无统一的操作标准，可参考STARD制定的循环游离DNA检测标准流程［17］，使不同实验室之间的检测结果具有可比性，为循环游离DNA定量检测的临床应用奠定基础。

3 循环游离DNA的定性检测

乳腺癌与基因突变存在着密切关系，某些驱动突变（driver mutations）可能直接导致乳腺癌的发生。以往致病性突变检测需行活检或手术切除的肿瘤组织检查，特别是组织活检作为确诊依据虽必不可少，但属于有创检查。因循环肿瘤DNA具有与乳腺癌组织相同的特征，因此对之进行检测是对以往诊断方法的补充，尤其是对于原发病灶已切除的患者，其血浆中的循环肿瘤DNA可作为疗效判定、预后检测的可靠指标。

Dawson等［18］在《新英格兰医学杂志》上首次报道了循环肿瘤DNA在乳腺癌患者预后监测中的应用。该研究同时应用了数字PCR及高通量测序，检测了血浆循环游离DNA中与乳腺癌发生发展相关的体细

胞突变（PIK3CA、TP53等基因突变），携带乳腺癌相关体细胞突变的拷贝被认定是循环肿瘤DNA。在对30例携带PIK3CA、TP53基因突变患者的循环肿瘤DNA水平进行分析后发现，循环肿瘤DNA水平的变化与该患者的治疗及预后情况基本一致。也就是说对于治疗前检测出循环肿瘤DNA的患者，其循环肿瘤DNA的水平在接受治疗后出现下降，治疗结束后如出现循环肿瘤DNA水平升高，提示该患者预后不良，存在较高的复发转移风险。该研究亦将血液中的循环肿瘤DNA、CA15-3、循环肿瘤细胞3个生物学指标进行了对比，发现循环肿瘤DNA的敏感性和特异性均高于后两者。同时该研究对于循环肿瘤DNA的临床应用无疑起到了巨大的促进作用，但由于检测敏感性低、成本高等原因，循环肿瘤DNA目前尚未大规模应用于临床。

因体细胞突变频率低，提取及检测过程中均面临着很大挑战。体细胞突变主要在小片段的循环游离DNA中发现［6］，提取过程中小片段的丢失可导致检测敏感性降低。QIAGEN试剂盒对小片段循环游离DNA提取效果较好，是目前推荐使用的提取试剂盒［14］。基因突变的检测技术也取得了很大的发展，高通量测序可以在5 000个基因拷贝中发现1个携带突变的拷贝［19］，而近年迅速发展的数字PCR进一步提高了循环游离DNA突变检测的敏感性。Beaver等［20］对15例携带PIK3CA突变的早期乳腺癌患者的循环游离DNA进行了数字PCR检测，其中14例在血浆循环游离DNA中检测到同样的PIK3CA突变（敏感性93.3%），而未携带PIK3CA突变的患者均未检测到突变（特异性100%）。数字PCR虽然具有较高的敏感性，但只能检测已知突变，且成本和操作时间会随着检测位点的增多而显著增加。高通量测序在检测循环游离DNA突变中仍占据不可替代的位置，但其较高的检测成本成为临床应用的一大障碍。Newman等［21］在对肺癌患者的研究中，建立了一种个体化的循环游离DNA测序方法，称为CAPP-Seq。CAPPSeq只需检测约125 kb的碱基，就可以涵盖96%肺癌患者，大幅度降低了测序成本，为循环游离DNA检测的大规模临床应用开辟了道路，也为乳腺癌中循环游离DNA的检测提供了模板。

肿瘤化疗的耐药发生与基因突变关系密切。连续进行肿瘤组织活检是有创且有些时候不可行，此时就需要一种更佳的活检方法检测化疗中耐药的发生发展，循环游离DNA成为目前最好的选择。Murtaza等［22］对6例癌症患者（其中包括2例乳腺癌）进行了连续血浆标本收集，随着化疗的进行，发现一些与癌症发生及耐药相关的基因突变位点的等位基因频率明显增加，甚至有一些新的突变位点产生。这证实了癌症在化疗过程中是不断进化的，同时也为检测癌症的治疗效果、指导用药提供了可靠的依据。

甲基化状态异常也被认为是癌症发生的原因之一。一些启动子区的甲基化只存在于癌症患者中，如CST6基因启动子区的甲基化仅在乳腺癌患者的血浆中检出，而健康对照者中未检出［23］。比较常见的是癌症患者与健康人的甲基化水平不同。在血清中检测乳腺癌患者MDR1基因CpG岛的甲基化发现，低甲基化水平与肿瘤体积大、期别较晚有相关性，该检测方法特异性为98%，敏感性仅50%［24］。甲基化状态也可作为评价治疗效果和预后的指标之一。在血清中检测RASSF1A基因的甲基化状态可作为影响他莫西芬疗效的独立因素，携带RASSF1A基因甲基化患者的复发和死亡率较高［25］。循环游离DNA甲基化状态的检测对乳腺癌治疗和预后也具有一定价值。

约25%中国乳腺癌患者存在HER-2蛋白表达和拷贝数的增加。虽然血浆中循环游离DNA可检出HER-2拷贝数的增加，但一项研究显示治疗前后HER-2阳性患者与健康对照组并无明显差别［26］。这一结果可能是应用实时定量PCR检测循环游离DNA敏感性较低所致。利用数字PCR对乳腺癌患者循环游离DNA中HER-2拷贝数的改变比较准确地进行了评价，ROC曲线下面积为0.92［27］。因血浆循环游离DNA的片段化程度高，且无固定的参照，因此检测拷贝数的改变存在着一定困难。随着检测方法的不断完善，作为基因诊断的一部分，循环游离DNA的HER-2拷贝数检测可能具有广阔的临床应用前景。

目前普遍的观点是来源于坏死肿瘤细胞的循环游离DNA的片段更长，因此可以利用较长与较短循环游离DNA片段数量的比值，即循环游离DNA的完整性来评价其中较长片段所占比例。血清循环游离DNA的完整性在乳腺癌患者，特别是肿瘤体积大、淋巴结转移多的患者中明显升高［28］。血浆循环游离DNA的完整性在转移性乳腺癌患者中也明显升高［29］。因此，血清和血浆循环游离DNA均可以用于DNA完整性的检测，对评价肿瘤负荷具有一定意义。

杂合子丢失（loss of heterozygosity，LOH）也是癌症患者基因组中常见的现象，针对乳腺癌中多个抑癌基因的LOH检测发现，在循环游离DNA中检测LOH可作为乳腺癌患者的预后判定指标［30］。

4 结语

随着基础研究的不断深入以及转化医学的迅速发展，循环游离DNA在乳腺癌诊疗过程中的作用引起广泛重视，但目前尚未看到循环游离DNA检测的大规模临床应用。如果循环游离DNA检测在日常临

床工作中要占据一席之地，检测流程的标准化是需要迈出的第一步。

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（2014-12-31收稿）

（2015-02-10修回）

Clinical utility of circulating cell-free DNAin breast cancer

Da PANG1,2,Bingshu XIA1,Xianyu ZHANG1

Da PANG;E-mail:pangda@ems.hrbmu.edu.cn

Circulating cell-free DNA(cfDNA),which is released by normal cells and cancer cells,is defined as extracellular DNA in the blood.The cfDNA levels in breast cancer patients are higher than those in healthy control donors.cfDNA also carries the features of tumor tissue,such as mutations,methylations,copy number changes,and loss of heterozygosis.cfDNA is a potential biomarker in the diagnosis,management,and prognosis of breast cancer.In this review,the authors briefly describe the biological features of cfDNA,and discuss its clinical utility as a blood biomarker in quantitative and qualitative research.

circulating cell-free DNA,circulating tumor DNA,cancer biomarker,breast cancer

10.3969/j.issn.1000-8179.20142155

①哈尔滨医科大学（哈尔滨市150081）；②哈尔滨医科大学附属肿瘤医院乳腺外科

庞达pangda@ems.hrbmu.edu.cn

1Harbin Medical University,Harbin 150081,China;2Breast Surgery Department,Harbin Medical University Cancer Hospital 150084,China