动物疫病诊断中多重PCR技术的应用

2015-01-23刘海成内蒙古巴彦淖尔市动物疫病预防控制中心015000

中国畜禽种业 2015年8期

关键词：猪链球菌寄生虫病原

刘海成（内蒙古巴彦淖尔市动物疫病预防控制中心 015000）

动物疫病诊断中多重PCR技术的应用

刘海成（内蒙古巴彦淖尔市动物疫病预防控制中心 015000）

随着PCR技术的不断发展，现在逐渐诞生一种多重PCR技术，这种技术能够一次性的鉴别多重疾病，使得疫病诊断上升到了分子水平，有着非常大的优势，本文从实际的工作经验出发，探索多重PCR技术在动物疫病诊断中的应用。

动物疫病诊断；多重PCR技术；DNA体外扩增

PCR技术又叫聚合酶链式反应，也叫体外扩增技术。随着PCR技术的发展以及在实际生产中的应用，为人们在疫病诊断提供了丰富的经验和科研素材，人们对于疫病诊断技术也越来越成熟，多重PCR技术就是在这个基础上发展而来的。它在保证高敏感度和高效率基础下，能够一次性的完成对多个疾病的诊断过程。多重PCR技术最早应用于疾病诊断是在1988年对人类杜氏肌营养不良基因外显因子的诊断过程，后来逐渐的被应用于动物疫病的诊断当中，实践证明，多重PCR技术对于动物疫病中的细菌性、病毒性、寄生虫疾病有着非常快速、准确、特异的诊断方法。

1 多重PCR技术的特点

多重PCR技术整体上和常规的PCR技术相差无几，位移的不同点是多重PCR技术是在同一体系中加入了多对引物，能够对同一反映体系中的多个病原微生物进行检测，或者同一微生物多个类别的目的基因进行分型，从而实现一次性完成多个病原体微生物的检测过程，从而大大地降低了检测的时间，节省了试剂的用量，而且诊断过程和PCR技术一样非常的具备准确性和特异性。需要注意的多重PCR技术的引物设计和反应条件要求非常的高，这也是实现多个疫病诊断的重要环节。另外在多重PCR技术的优化过程中可能会遇到扩增产物很少甚至消失的情况，特别注重对引物的设计过程，从而保证多重PCR技术的精确性[1]。

2 多重PCR技术在动物疫病诊断中的应用

2.1 应用于流行病学调查

在流行病学调查中重要的一点就是对猪链球菌的检测，这种病菌是引起脑膜炎、关节炎、肺炎等疫病的重要原因之一。由于这类细菌K抗原的不同，猪链球菌可以分为35种不同血清类型。多重PCR技术能够对多个血清类型的猪链球菌进行检测，由于临床学上认为仔猪感染的主要的感染源来自于亚临床感染的猪。为此对于这些猪的疫病监测能够很好的了解猪链球菌的流行病学的机理，从而对疫病进行很好的控制。根据Henk和Wis等人的研究成果，该菌检测的时候采用了3对引物，这三对引物的设计主要是为了对应epf基因编码中EF蛋白1型和高致病性2型菌株，为了避免假阴性带来的干扰效果，格局pGL2-B质粒设计了一个作为内部阳性对照效果的949bp引物，并设计实验选用了45份猪扁桃体样本，使用多重PCR技术进行检测得到的结果和传统的细菌学方法结果呈现一致性，但是速度明显要快于常规的细菌学检测的方法，而且能够特异性和敏感的诊断出1（14）、2（1/2）、7、9以及2型弱毒猪链球菌[2]。

2.2 应用于类症鉴别

其中造成鸡群呼吸道传染病的感染源有多种，常见的有禽流感、鸡传染性喉气管炎、鸡新城疫、鸡毒霉形体等。而且对于不同年龄阶段的鸡群感染也具有不同的针对性，这些疾病由于拥有高发病率和死亡率所以危险性极高，如果不能有效的检测和控制会给养鸡户或者养鸡场造成巨大的经济损失。由于造成的临床表现相似，因此从解剖学的角度无法进行区分，而且在实际的检测中不仅干扰项非常的多而且操作也非常的麻烦，为此我们引入了多重PCR技术实现对该类传染病病原的检测过程。具体的操作为：首先根据以上几种病原体各自的保守序列选择6对引物，扩增的长度分别为1050bp、 1720bp、 732bp、 674bp、 310bp、 207bp 的片段，并改进三温式多重PCR技术，使用二温式多重PCR技术检测这几种病原体感染，实验结果显示，多重PCR技术能够很好的实现对这六种病原的检测过程，而且检测效率和准确性非常的高，具有非常好的临床效果[3]。

2.3 应用于病原微生物的分型鉴定

根据谢芝勋等人的研究，以M基因和HA基因作为靶基因设计了3对引物，利用这三对引物分别对AIV H5和H7亚型特异性引物进行了检测，利用引物扩增了三种不同长度的cDNA片段，并且通过多重PCR技术进行优化成功的实现了对AIV、H5、H7的分型多重PCR技术的鉴定试验。实验结果显示分型鉴定的具备PCR技术中的特异性和敏感性。根据引物对不同亚型病原微生物的cDNA片段不同，表现出多重PCR技术的微生物分型鉴定中应用的科学性和临床可行性。

2.4 应用于动物寄生虫诊断

由于临床检查手段的限制，对于很多在反刍动物胃肠道中寄生虫的诊断效果非常差，在动物感染以后常规的检测手段很难发现几种寄生虫之间的区别，例如蛇形毛圆线虫和奥式奥斯特他线虫在外型上就十分的相似，在对于这些相似的寄生虫进行诊断的时候常规的临床检测遇到了困难，使用常规的观察法和虫卵检测的结果的准确性很难保证，严重地影响了动物疫病诊断的效果，因此Zar就利用多重PCR技术实现了对多种动物寄生虫的诊断过程，同样的是利用几种寄生虫rDNA重复序列中特殊序列段的差异的不同设计了几对特异性的引物对，从而实现了对多种线虫的检测。同时对几种线虫的单一DNA模板进行了敏感性实验，实验结果显示特异性片段基本不受干扰能够进行有效的扩增，验证了足够的敏感性。

3 多重PCR技术存在的问题与发展

多重PCR技术保留了常规PCR技术的特异性和敏感性的同时，具有对多个基因的一次性检测的过程，优势非常的明显，在动物疫病检测中的应用也非常的广泛。特别是在多重感染、流行病学、多种寄生虫的检测比常规的检测办法更加的优越。但同时多重PCR技术也存在着一定的问题和缺陷，主要表现在：首先由于扩增反应抑制物以及孔间温差的存在，导致可能会假阴性结果的出现，其次由于病原体之间的交叉感染导致的假阳性结果。其次是多重PCR技术由于较高的技术成本和设备投入导致非常的昂贵，没有办法大面积的普及，而且由于实践经验的不足导致多重PCR技术还没有形成完善的操作规范。