胶体金免疫层析技术在兽医领域的应用

吕春华舒展漆月黄杨波

（1，新疆维吾尔自治区阿勒泰地区动物疾病控制与诊断中心 836500；2，广州悦洋生物技术有限公司 510300）

胶体金免疫层析技术在兽医领域的应用

吕春华1舒展1漆月2黄杨波1

（1，新疆维吾尔自治区阿勒泰地区动物疾病控制与诊断中心 836500；2，广州悦洋生物技术有限公司 510300）

胶体金免疫层析技术自上个世纪面世以来就以其简便、特异、敏感、快速无需设备和专业人员的优点被广泛应用于生物医学和临床诊断等领域，文中介绍该技术在兽医临床诊断和现场快速检测上的发展进程，展现了巨大的发展潜力和广阔的应用前景。

胶体金免疫层析技术；兽医；发展进程；应用前景；展望；综述

胶体金免疫层析技术（Gold-immunochromatography assay，GICA）是在酶联免疫吸附试验（ELISA）、单克隆抗体技术、胶体金技术、乳胶凝集试验、免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的一种快速、敏感的免疫检测技术，现在该技术已成为继荧光标记技术、酶标记技术和放射性同位素标记技术之后又一重要的免疫标记技术[1]。本文就将对GICA技术的发展进程、原理及其在兽医临床中的应用几个方面进行介绍。

1 GICA技术的发展进程

英国著名物理学家、化学家迈克尔?法拉第在1857年首次制备出胶体金，并发现胶体金由红色变为蓝色；这一重大发现，奠定了胶体金制备和应用的科学基础[2]。继1962年Feldherr等[3]首次提出将胶体金作为一种用于电子显微镜示踪标记物的观点后，1971年，Faulk等[4]首次将胶体金作为一种新型的有色标记物被应用于免疫学领域的研究，建立了一种以胶体金为显示信号的免疫标记技术。免疫胶体金技术一直是国内外学者的研究重点，并得到了飞速发展。1974年建立了间接免疫金染色法，1989年建立了斑点金免疫渗滤法，1990年Beggs等在免疫渗滤技术的基础上，建立了简易、快速的GICA法[5]。随着纳米技术的兴起和单克隆技术的成熟，GICA逐渐得到了有效完善和长足发展，现在在生物分子识别等生物医学、临床医学诊断和兽医领域已被广泛应用，现在已有实力强劲的商品化胶体金诊断试剂盒国际化生产商，例如专业生产动物诊断检测试剂的韩国安捷（Bionote），生产早孕试纸条的瑞士可丽蓝（Clearblue），生产食品安全检测试纸的台湾尖端等。

2 GICA技术原理

胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在不同性质和浓度的还原剂（如鞣酸、柠檬酸三钠、白磷、硼氢化钠和抗坏血酸等）作用下还原而成不同粒径的胶体金颗粒悬液，又称金溶胶。GICA技术的原理是先将已知的抗原或抗体以条带状包被到硝酸-纤维素（NC）膜载体上；点样后，样品溶液通过滤膜的毛细作用向前移动；同时，样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体（抗体或抗原）发生高特异性、高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域（检测线），通过可直接目测的胶体金颗粒在短时间内聚集而得到可目测的显色条带。GICA和ELISA一样可以根据胶体金标记物和包被物（捕获材料）的不同，原理上可以细分为双抗夹心法、间接法和竞争法等。

3 GICA在兽医临床中的应用

3.1 细菌性病原的检测

在兽医领域细菌性疾病很多并且很复杂，给临床诊断和实验室诊断都带来了很多麻烦，所以学者们也将GICA技术应用到针对细菌性病原引起的动物疾病检测方法的研究中。检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、猪链球菌、布鲁氏菌和牛分枝杆菌等细菌的GICA检测方法已研制成功[6]，下面笔者将着重介绍布鲁氏菌病和牛结核病两种疾病的胶体金诊断技术。

布鲁氏菌病（Brucellosis）是一种由布鲁氏菌（Brucella）引起的主要侵袭生殖系统的人畜共患传染病。该病是世界动物卫生组织（OIE）规定必须报告的动物疫病之一，我国也将其列入二类动物疫病中。近年来布鲁氏菌病在我国一些地区呈现上升趋势，特别是现在人民生活对奶制品需求的提高，促使奶牛和奶制品的贸易流通量增大，进一步扩散了疫情。有效控制布病的关键就是快速准确的对患病动物做出诊断并及时采取措施，所以国内外学者开展了布病GICA检测技术的研究，并且已有兽医技术人员在临床上使用进口的商品化试剂盒作为现场诊断布病的依据。中国兽医药品监察所和地方的动物疫病预防控制中心、动物卫生监督所等动物疫病监测机构对GICA技术与ELISA或其他血清学检测方法进行了试验对比，试验结果显示GICA有很好的敏感性和特异性，较ELISA和其他血清学检测方法更为快捷简便，完全能作为现场诊断布病的有效工具[7-9]。

牛结核病（Bovine Tuberculosis，bTB）是由牛结核分枝杆菌（Mycobacterium bovis）引起的一种慢性消耗性传染病，能感染人和多种动物，严重危害畜牧业和人类健康。牛结核病的诊断方法以结核菌素皮试试验为主，该方法不仅耗时长、费人力还存在很在检测人员的判定误差和非致病性分枝杆菌的非特异性影响；结合我国现在牛结核病防控的现状，所以很有必要研制出一种快捷简便、准确特异的牛结核病GICA检测方法。2007年，张书环[10]原核表达出牛结核分枝杆菌的特异性抗原蛋白MPB83和MPB70并分别作为胶体金标记抗原和检测线捕获抗原，制备出牛结核病抗体检测试纸条；此试纸条在应用中也表现出了优异的性能，与牛结核分枝杆菌培养符合率为85%，与韩国进口试纸条符合率为98.75%，与结核菌素皮试试验符合率也高达80%。GICA技术运用到牛结核病的常规监测中，对我国人结核病的防治也具有积极作用。

3.2 病毒性病原的检测

在畜牧行业往往引起动物出现疫情的病原很多，其中很大一部分是由病毒性疾病引起的，如引起初生仔猪严重腹泻死亡的猪流行性腹泻病毒（PEDV）、引起禽鸟和人感染的禽流感病毒（AIV）、引起犊牛腹泻的轮状病毒（RV）等等。如何在众多病原中做出科学、精确的诊断不仅需要临床兽医的扎实技术和丰富经验，还需要我们广大科研学者提供更加准确、便捷的诊断工具，此时GICA技术就是一个有效补充，例如：规模化猪场在防治仔猪腹泻中采取初乳管理方案时，就会采用PEDV胶体金检测卡进行病原筛查。

口蹄疫（FMD）被OIE排在A类疫病之首，我国畜牧业深受其害，现在有可以鉴别野毒和疫苗抗体的FMD GICA试纸条在市面上流通，为FMD的检测防治提供了可靠手段。蒋韬等[11]还建立了O型、A型、Asia1型FMDV定型诊断胶体金免疫层析方法，该方法不与口蹄疫临床症状类似的猪水泡病病毒、水泡性疹病毒、水泡性口炎病毒发生交叉反应，能检测到7.8×104LD50的病毒量，具有良好的特异性和敏感性。

王向鹏等[12]建立了快速、简便检测猪瘟病毒（CSFV）野毒的GICA方法，所制备的试纸条用于检测CSFV野毒感染的PK-15细胞培养物，该试纸条不与猪瘟兔化弱毒（HCLV）、猪细小病毒（PPV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒 2型（PCV-2）、伪狂犬病病毒（PRV）、PEDV和RV反应，具有良好的特异性、敏感性和重复性，初步达到了区分检测CSFV野毒株和弱毒株的目的。

李雪松等[13]建立了检测PRRSV的具有良好特异性、敏感性、重复性和实用性的GICA方法，为我国蓝耳病的快速诊断和防制提供了技术手段。Joon T Y等[14]研制了PRV的胶体金试纸条，该试纸条检测时只需25μL样品，整个检测过程仅需5min，并且与常见猪病不发生交叉反应。Kameyama K等[15]建立了快速检测BVDV的GICA试纸条，该方法与病毒分离鉴定的敏感性和特异性分别为100%和97.2%。

在禽类疾病方面，Zhang等[16]建立了检测鸡传染性支气管炎病毒（IBV）抗体的GICA法，彭伏虎[17]采取双抗夹心的方法研制了新城疫病毒（NDV）GICA试纸条。徐一鸣等[18]以胶体金标记AIV H3和H7亚型单克隆抗体，以纯化的马抗H3和H7亚型AIV多抗、山羊抗鼠二抗分别包被在检测线和质控线，制备成试纸条。该试纸条在试验中与血凝和血凝抑制试验、RT-PCR等检测方法结果相符，具有良好的特异性不与其它禽类病原和AIV其它血清亚型发生交叉反应。

3.3 寄生虫的检测

因为大多数寄生虫病是人兽共患疾病，所以对畜禽寄生虫病的诊断具有重要的公共卫生学意义。目前，文献报道弓形虫病、隐孢子虫病、日本血吸虫病、鞭虫病、旋毛虫病、片形吸虫病、猪带绦虫病、奶牛肝片吸虫病、羊东毕吸虫病、犬心丝虫病和犬弓首蛔虫病等疾病的胶体金检测试纸条已研制成功并应用于临床检测中。

张少华等[19]以胶体金标记猪带绦虫六钩蚴TSOL18重组蛋白抗原，制成了猪带绦虫GICA诊断试纸条。该试纸条与剖检计数法的相比敏感性为80.0%，与全囊虫抗原ELISA的相比敏感性和特异性分别为75.0%和95.2%。王艳华等[20]研制出敏感性高于IHA，与ELISA相当的检测弓形虫抗体的GICA试纸条，该试纸条能检出多种动物的弓形虫抗体IgG和IgM，具有良好的特异性。秦银霞等[21]建立的旋毛虫抗体检测试纸条，能检出多种动物感染旋毛虫后的阳性血清，且不与其他寄生虫病的阳性血清产生交互反应。

4 展望

GICA技术从首次报道以来，一直成为国内外学者研究的热点，通过几十年来不断的发展，GICA技术已广泛应用于各个领域中，其检测的范围也在不断扩大，现在GICA技术已用于检测疫病、激素、毒品、药物、重金属等方面。兽医领域现在使用GICA技术最多的是宠物医院，兽医对于犬瘟病毒（CDV）、犬细小病毒（CPV）、犬心丝虫等疾病的临床诊断主要都是参考商品化胶体金试剂盒的检测结果。随着兽医检测要求的不断提高，未来GICA技术还应该向增大检测范围、提高检测灵敏度、具有定量或半定量的功能、采用多联方式的方向发展。现阶段市面上已有AIV和H7或H9亚型AIV合在一起的检测试纸条，即一条试纸上拥有两条检测线；还有能根据检测线条带颜色深浅参照比色卡比对，起相对定量功能的试纸条。相信GICA技术依靠其快速、灵敏、特异、简便、稳定和不需要专业设备和专业技术人员的优点未来必将成为兽医技术人员现场诊断的首要参考工具。

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吕春华（1958.2-），男，在职兽医硕士，农业推广研究员，长期从事动物疫病防控及新技术示范应用推广工作。中国兽医协会第一届、第二届理事。最近几年主要从事兽医新技术应用推广工作。主持过新疆自治区科技厅成果推广项目3个，主持过阿勒泰地区科技推广项目5个，阿勒泰地区重大科技项目1个，撰写制定或参与制定阿勒泰地区地方标准10余个。目前主要从事胶体金快速检测盒的示范应用与推广工作。