循环肿瘤细胞检测技术及临床应用



循环肿瘤细胞检测技术及临床应用

曹雅楠，庄文芳，盛慧明*

(上海交通大学医学院附属同仁医院 检验科，上海200336)

循环肿瘤细胞(circulatin tumorcells,CTC)计数有助于早期诊断肿瘤转移，反映患者的治疗效果及肿瘤预后。近年来循环肿瘤细胞检测的广泛应用大力推进了相关技术的发展。本文对近年来外周血循环肿瘤细胞检测技术的发展，临床及研究领域的应用情况及未来展望做一简要综述。

循环肿瘤细胞(CTC)一经发现，就得到了广泛重视，CTC被认为是肿瘤播散转移的标志。研究表明，肿瘤组织每天会释放大量肿瘤细胞入血，但在循环中的存活率极低，大多会发生凋亡，只有少量具有强侵袭力的肿瘤细胞可表达凋亡抑制因子得以存活[1]，这些存活下来的肿瘤细胞即CTC。CTC在外周血中含量极少，一般每106-107个白细胞中仅含有1个。所以，CTC检测首先要进行细胞富集，以提高检测灵敏度，再对富集的细胞进行CTC检测。

1CTC富集技术

1.1　以形态学为基础的富集

CTC细胞体积大，直径超过25 μm,胞核形状不规则，核浆比异常。肿瘤细胞体积分离法和核孔分析技术通过滤网可将直径大于8 μm的肿瘤细胞分离，但此类方法敏感性较低[2]。基于密度梯度分离原则的Oncoquick，利用单个核细胞较其它血液成分相比密度低，采用1.077 g/ml的密度梯度将单个核细胞和肿瘤细胞与血液其它成分分离，同时增加设置多孔屏障，进而分离得到更加纯化的目的细胞[3]。

1.2　以免疫学为基础的富集

免疫磁珠法将磁性微珠包被单抗形成免疫磁珠，再结合靶细胞上的对应抗原形成抗原-抗体-磁珠复合物，在外加磁场作用下定向移动、吸附，进而与其它细胞分离。该分离技术的方法有两种：(1)阳性分离法是直接从细胞混合液中分离出靶细胞；(2)阴性分离法则是利用免疫磁珠去除无关细胞，利用抗CD45抗体或抗CD61抗体去除血液中的巨核细胞和血小板，使靶细胞得以纯化[4]。广泛的阴性分选可选用抗CD2、CD16、CD19、CD36、CD38及血型糖蛋白A抗体等。两种方法相比较，阳性分离法对肿瘤细胞的富集率较高。免疫学方法与形态学方法相比，具有操作简便快速，保持细胞活性，高选择性等优点，而且外加磁场也不会影响分离液中的带电溶质的运动。

如磁性活化细胞分选系统(magnetic activated cell sorting system,MACS)，细胞首先采用胞膜或胞内染色，然后通

过免疫磁性标记的微球来捕获靶细胞。EpCAM是肿瘤相关钙传导信号1(CD326)，属于参与细胞间粘附的细胞表面分子，在多数上皮肿瘤细胞高表达。磁性微球连接EpCAM可富集上皮来源的CTC，此方法在进行高剂量化疗的乳腺癌患者中阳性选择率较高[5]。

1.3　形态学基础和免疫学基础相结合的富集

还有兼顾上述两种原理的结合性富集方法，如Rosettesep-applied imaging rare event(RARE)，该方法结合了密度梯度分离和抗体介导分离两个步骤。首先在阴性分选过程中，CD45阳性细胞与多种红细胞交联结合形成双特异性四聚抗体复合物，再利用密度梯度离心法将这些复合物去除，CD45阴性的单核细胞即可得以分离[6]。

2CTC检测技术

2.1　细胞计数法

最早应用于检测外周血CTC的方法，基于细胞膜表面的特异分子标志物来分离和计数CTC。较核酸分离方法，其优点在于细胞未被破坏，保持完整，可在形态学上鉴别恶性表型和在单个细胞水平进行分子特性分析。免疫细胞化学法(immunocytochemistry，ICC)是指以显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和细胞化学呈色反应，对相应抗原进行定位、定性和定量的技术。但此方法敏感性低、检测繁琐、易误诊。目前较常用的细胞角蛋白(Cytokeratin，CK)抗体能与巨噬细胞、浆细胞及有核造血细胞前体特异或非特异结合[7]，MUC-1可与红系祖细胞结合。使用CD45的对比染色使得这种情况有所改善。在乳腺癌中，常使用已有的乳腺癌特异性抗体进行CTC筛选，如HER2、抗乳球蛋白等，但并非所有乳腺癌细胞均表达这些标示物，因此会产生假阴性结果，而多种标志物联合使用，能有效提高此方法检测的敏感性和特异性[8]。近年来，在此方法基础上发展出了许多改良技术。其中，光纤阵列扫描术(Fiber-optic Arry Scanning Technology， FAST)配置了扩大视野的光学收集系统，能够进行连续扫描，有效避免了纯化和富集步骤造成的CTC丢失，能从大量免疫荧光染色的单核细胞中找出CTC。据报道，利用FAST对三份混入10-21个人结直肠癌HT-29细胞的外周血标本进行检测，平均敏感性达到98%[9]。镭射扫描细胞技术器(laser scanning cytometer LSC)则是在联合使用抗人上皮抗体和抗CD45抗体标记细胞后，采用前向散射作为其门限参数分析荧光，使背景荧光改变的修正得以提高，进而提高了其检测精度，并能在众多阳性细胞中重新定位CTC，通过显微镜进行视觉确认，有效提高了扫描荧光染色细胞的有效率[10]。自动细胞显像系统(antomated cellular imaging system,ACIS)是一种能更快检测载玻片的自动扫描显微镜，联合应用了免疫细胞化学检测与其他自动扫描系统，使检测系统具有很好的协同性，且能在初步扫描和分析结束后进行影像回顾和形态学分类。

流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)有机的整和了计算机技术、激光技术、电子技术、流体力学、细胞免疫学和单克隆抗体技术等多种高新技术方法，不仅能鉴定特定标本中细胞抗原性和形态学特征，还能通过分选富集目的细胞，保持细胞形态和活力，进而对其进行功能学研究。但FCM检测靶细胞的敏感度约为1/1-10万，而外周血中CTC数量常少于1/100万，因此，CTC的细胞数量在一定程度上限制了FCM在此领域的应用[11]。

2.2　核酸检测法

通过检测肿瘤细胞的特异遗传学改变来确认CTC的存在，如原癌基因、抑癌基因突变或染色体异常重排，微卫星不稳定性、致瘤病毒序列等，均可用于检测。

聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)，是检测CTC敏感度较高的一种方法，检出率可达1/(1-10)×106个正常细胞。但是，除了少数实体肿瘤的染色体突变或基因突变，绝大多数实体肿瘤的DNA变化没有明显的特异性，很少能用于CTC检测。此外，DNA改变的出现仅存在于混合型损伤以及成熟的肿瘤中，外周血中CTC和核酸的半衰期也不稳定，检测到游离DNA仅能反映核酸的存在，而不能证明是否存在真正的肿瘤细胞，因此应用PCR技术检测CTC的特异性还有待进一步研究。

逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction,rt-PCR)是在PCR基础上扩增由肿瘤特异性mRNA序列逆转录的DNA片段，能检测到组织或肿瘤的特异性mRNA的表达或突变基因的RNA水平异常。这些RNA通常不表达于正常外周血细胞，且半衰期较短，细胞死亡后，RNA可迅速从血中降解，因此检测到RNA可间接代表完整肿瘤细胞的特性[12]。研究表明，RT-PCR的敏感性要比免疫细胞化学的方法敏感性高很多，可从107-108个外周血单个核细胞中检测到单个CTC[13]。然而，RT-PCR是以某个肿瘤标志物的mRNA为标志物，目的基因在正常细胞表达以及样品污染等因素都易使RT-PCR产生假阳性。研究显示，一些单纯炎症反应也可以引起肿瘤抗原mRNA的升高，所以癌症患者伴随炎症反应也可能会增加RT-PCR方法测定CTC的假阳性率[14]。此外，游离RNA和杂交DNA也可能导致假阳性，影响CTC检测的特异性[15]。

CTC核酸检测方法具有高敏感度，但是，由于缺乏真正的肿瘤特异性标志物使得该方法特异性较低，易产生假阳性。近年来，实时定量探针-PCR、实时定量荧光-PCR，巢式定量-PCR等新方法，采用特异探针和实时定量双重特性，提高了扩增效率和检测敏感度，目前应用较广泛，被认为是检测CTC有效的方法。

3富集和检测相结合的技术

3.1　CellSearch

是目前美国FDA批准的的唯一一项应用于临床的CTC检测技术，广泛应用于转移性乳腺癌，肺癌，结直肠癌，肺癌，胃癌，胰腺癌，卵巢癌，膀胱癌等癌症病人的临床监测。CellSearch 通过载有抗EpCAM抗体的铁磁流体对CTC进行富集，用DNA染料固定核酸，将CK和DAPI对CTC进行荧光抗体染色，并用CD45，角蛋白8，18和19对其余血细胞进行对比染色。使用自动荧光显微镜对CK+/DAPI+/CD45-细胞进行计数。使用7.5ml的血液样本可从400多亿血细胞中检测到单个CTC，对转移癌的诊断具有很高特异性，并适用于所有类型的肿瘤细胞。作为一种半自动化检测工具，此系统既减少了人为因素的误差，也实现了实验室之间的结果标准化[16]。受限于缺乏肿瘤特异性抗原，此方法也会存在漏诊。此外，使用CellSearch设备，用CD105代替细胞角蛋白抗体能够计数内皮细胞，研究显示在转移性肿瘤患者和心血管疾病患者中内皮细胞计数增加[17]。用高分子量黑色素瘤抗体代替细胞角蛋白抗体能够计数黑色素瘤细胞[18]，此类细胞出现常意味着临床预后差。

3.2　上皮免疫斑点法(Epithelia immunospot,EPISPOT)

是酶联免疫吸附测定原理发展的免疫学分析方法。通过免疫磁珠去除CD45+细胞，再用CXCR4(肿瘤细胞归巢过程中的趋化因子受体)阳性细胞富集CTC[19]。EPISPOT检测如cathepsin-D(一种半胱氨酸蛋白酶)、Mucirr1等肿瘤患者外周血CTC释放的特异性蛋白，来计数分泌这些蛋白的存活的CTC，这些CTC是具有转移潜能的活细胞，较凋亡细胞而言更具临床相关性[20]。

3.3　CTC芯片(CTC-Chip)

是一种能检测出血液中极微量癌细胞的微流体硅芯片，在芯片表层排布了78000个包被EpCAM抗体的微位点，当血液标本流过芯片时，该抗体通过抗原-抗体反应捕获CTC，使得CTC粘附在芯片上。该检测系统选用CKs和DAPI作为阳性分析指标，CD45作为阴性分析指标。可在10亿以上血细胞检测出单个癌细胞，敏感性非常高，并适用于所有类型肿瘤患者的外周血样本[21]。第二代CTC-Chip称为HB-Chip(herringbone-chip)，通过改进该芯片构造，使血液标本流经芯片时形成微漩涡，增加了芯片表面包被抗体捕获CTC的机会，更加有效捕获数量极少的CTC，可捕获血液中90%以上的癌细胞，还能捕捉到其它CTC分离设备未发现过的肿瘤细胞团块[22]。此芯片还安装了一个标准载玻片，使用传统病理检查方法鉴别癌细胞，为肿瘤转移机制研究提供了新型平台。

4CTC检测临床应用

4.1　乳腺癌

近年来，在乳腺癌患者骨髓中检测播散肿瘤细胞(disseminated tumor cells DTC)和外周血中检测CTC已是肿瘤扩展的研究要点。约30%-40%的初期乳腺癌患者中可检测到DTC，且检测结果与临床预后呈临床相关性，但由于骨髓穿刺属于创伤性检查，外周血CTC检测成为一种理想的方式。临床试验显示，CTC检测成为了初发和转移性肿瘤预后的良好评估指标，且对治疗监测和肿瘤转移早期生物靶向治疗提供了良好指征[23]。在CTC研究领域，乳腺癌的CTC检测是研究最具体，检测手段最多的，其临床价值也得到了广泛认可。对42例N~O期的乳腺癌患者检测发现，CTC总阳性率为48.6%，长期随访结果显示，CTC阳性患者的无病生存期(disease free survival,DFS)、总生存期(overall survival,OS)均较CTC阴性患者短[24]。使用RT-PCR方法对214例术后辅助化疗完成的临床Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌患者进行CTC检测，总阳性率为21%，随访发现，CTC阳性组发生远处转移的概率明显高于CTC阴性组，且阳性组的无病间隔(disease free interval,DFS)也明显较阴性组短[25]。对98例转移性乳腺癌患者进行外周血标本的CEA和CA15-3检测，采用CellSearch进行CTC检测，结果显示，45例(45.9%)为CTC阳性，CTC阳性组较阴性组存活率明显差。71例(72.4%)存在肿瘤标志物(TM)水平增高。在正常TM组中，CTC阳性群体较CTC阴性群体存活率也显著缩短。因此CTC成为转移性或发展性乳腺癌患者有力辅助诊断指标。在多因素分析中，CTC检测可作为唯一的显著总生存率预测因素[26]。对1944例转移性乳腺癌病人进行CTC检测研究，其中，911例(46.9%)CTC计数≥5个/7.5 ml血液组与CTC计数<5个/7.5 ml血液病人相比较，无恶化生存率和总生存率均有显著差异。临床病理预测模型加入CTC计数因素对生存率预测准确率显著提高。模型加入治疗后3-5周和6-8周的CTC计数后，准确率进一步提高。而癌胚抗原和CA15-3抗原水平对预测模型无明显帮助[27]。

大量研究证实，CTC检测也能反映患者对于治疗方案的敏感程度。CellSearch检测系统对300例中国乳腺癌患者分别在治疗前，治疗后3-4周，治疗后6-8周进行外周血CTC检测，并绘制无恶化生存曲线PFS，分析CTC动态变化对PFS改善的关系，结果提示CTC动态变化能够预测患者疾病进展风险的改善，并在治疗监测中具有重要意义[28]。对118例乳腺癌患者进行治疗前后CTC水平的联合监测发现，CTC计数情况与原发肿瘤情况无直接相关，但可作为早期肿瘤复发的独立预后因素[29]。将179例乳腺癌患者分为新辅助疗法组(38)，辅助疗法组(100)和肿瘤扩散组(41)，采用RT-PCR方法进行检测，新辅助疗法组35%未发现转移的早期乳腺癌患者检测到CTC阳性，辅助疗法组CTC阳性率为26%，肿瘤扩散病人中有43%阳性。在治疗后，新辅助疗法组阳性率减为5%，辅助疗法组减为13%，肿瘤扩散组减为12%。治疗后CTC阳性率可以辨别具有高转移风险的病人组，即使对化疗前CTC阴性的病人也适用。多元素分析显示，CTC阳性和临床病理特征，如肿瘤大小，受体激素状态，转移性节点等无明显关系。CTC状态对于早期乳腺癌管理治疗等有显著意义。另一方面，对乳腺癌病人来说，膜蛋白Her-2的状态对于个体化治疗意义非凡，临床常通过手术取出肿瘤进行Her-2状态分析，但这并不能代表转移的肿瘤。CTC已经被证实在靶向治疗中其蛋白和基因水平具有多样性。而通过对检测到的CTC进行相关蛋白表达水平的分析，能够有力指导制定患者个体化治疗方案。将来，CTC也将逐步替代一些治疗效果监测指标，如Bcl-2，Her-2，AR，IGFRI等，成为治疗效果评估的重要因素。

4.2　肺癌

微芯片技术在肺癌病人的CTC检测中研究最深入。与其它实体肿瘤相比，非小细胞性肺癌(NSCLC)患者外周血中CTC相对较少，但由于缺少其它特异性肿瘤标志物，CTC评估对NSCLC的预后评估具有重要意义。据研究报道，CTC对于转移较快，急需早期诊断的小细胞癌意义更明显[30]。对50例小细胞肺癌患者检测CTC计数，结果显示其中位数为28个(每7.5ml)，高于其它类型的肺癌，且CTC计数越多预后越差[31]。对60例SCLC癌患者进行治疗前，第一轮化疗后和化疗后的CTC检测，结果显示，治疗前90%(54/60)患者CTC计数阳性，且CTC计数与扩散器官数呈明显正相关。化疗后，高于89%的病人CTC减少，且化疗后CTC计数与临床预后和死亡风险呈显著相关，证明CTC计数对扩散性小细胞癌患者预后有显著意义[32]。对67例骨转移的肺癌患者和30例无转移的肺癌患者进行CTC检测，及其它临床资料进行分析，结果显示，骨转移组与无转移组相比，CTC阳性率显著增高。CTC技术与其它临床因素，如年龄，性别，肿瘤类型，肺内转移，淋巴结转移等无明显关联，但CTC阳性组肺内转移和淋巴结转移发生率高于CTC阴性组[33]。有报道用微芯片技术分离转移性非小细胞肺癌患者外周血中的CTC，并对其进行EGFR突变和酪氨酸激酶抑制剂耐药相关基因检测，检出率可高达92%，且对分子靶向药物使用具有良好指导作用[34]。CTC计数也广泛应用于肺癌患者疗效评估的研究中，例如Martin[35]等就用CTC计数来监测27例非小细胞性肺癌患者对放射治疗的敏感情况，从而对患者治疗方案进行调整。

无论在SCLC还是NSCLC中，均证实了CTC计数是重要的预后因素，且治疗前后CTC水平很好的反映了病人对治疗的反应情况。而且，CTC的分子水平检测结果与非小细胞性肺癌的各分子亚型具有良好相关性。例如对8例EGFR突变的肺癌患者研究显示，无EGFR突变的CTC出现与治疗反应相关[36]。在分子水平定义的非小细胞性肺癌亚型中，对CTC的分子水平的检测也证实了不同亚型间肿瘤细胞的分子水平存在差异。

4.3　其他

近年来，CTC计数快速发展，并广泛应用于各类肿瘤中。虽然许多血清肿瘤标志物如前列腺特异抗原(PSA)、癌胚抗原(CEA)等已经广泛应用于人群的肿瘤筛查，但是普遍存在特异性不高，甚至导致假阳性结果。CTC检测技术为实体肿瘤的诊断和预后监测提供了新的有力手段。Blumke K[37]等对来自两个研究中心的214名肾癌患者进行肾脏切除前或后，以及化疗前后的CTC监测和随访，结果显示，62%检测出CTC的病人两年内发生了癌细胞扩散或病人死亡。而CTC的出现不仅与肿瘤分期有一定相关性，与肿瘤侵袭力也相关。129例上皮卵巢癌患者进行术前侵略性CTC(iCTC)检测，结果显示，对I期和II期的上皮卵巢癌患者而言，iCTC敏感性为41.2%，特异性为95.1%，阳性预测率为77.8%。CA125对I期和II期的上皮卵巢癌患者阳性预测率为61.1%，总预测率为92.1%，特异性为76.2%。且iCTC与血清CA125相比，与总生存率和无恶化生存率相关性更强[38]。另据报道，在泌尿生殖系统肿瘤，包括前列腺癌，肾癌，膀胱癌，肾上皮细胞癌，尤其对于切除抵抗的前列腺癌患者是有力的预后工具[39]。CTC能协助早期诊断肿瘤，小创伤的检测肿瘤病理变化，并作为治疗反应标志物有效帮助临床调整治疗方案。

此外在胰腺癌、脑癌中，CTC检测也在逐步应用。对一例转移性脑癌患者脑脊液进行CTC的检测，证实了此患者转移的脑部肿瘤为乳腺起源，脑脊液的CTC检测也可作为特殊的标志物用于诊断和治疗反应评估[40]。对一例转移性食道癌患者使用CellSearch进行外周血和腹水的CTC检测，证实了循环肿瘤细胞的食道癌来源，以及CellSearch 也可应用于腹水的CTC检测。

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(收稿日期：2014-10-13)

文章编号：1007-4287(2015)07-1223-05

*通讯作者

基金项目:上海市科委自然基金项目(15ZR1437900)资助