氧化石墨烯与核酸适配体在检测方面应用的进展

林彦锋，刘宇洋，高顺祥，王梁华，胡波Δ

(1.第二军医大学 学员旅，上海 200433；2．第二军医大学 海洋生物医药研究中心 生物化学与分子生物学教研室，上海 200433)



氧化石墨烯与核酸适配体在检测方面应用的进展

林彦锋1，刘宇洋1，高顺祥2，王梁华2，胡波2Δ

(1.第二军医大学 学员旅，上海 200433；2．第二军医大学 海洋生物医药研究中心 生物化学与分子生物学教研室，上海 200433)

核酸适配体是一类能与靶物质高亲和力和特异性结合的寡核苷酸链，氧化石墨烯是一种具有多种独特理化性质的新兴材料，近年来它逐渐应用到了核酸适配体领域并取得了一系列进展。本文综述了近年来氧化石墨烯与核酸适配体针对小分子及金属离子、生物大分子和细胞等不同靶物质的检测方面的应用进展，以期为氧化石墨烯在适配体检测领域的大规模应用提供参考。

适配体；氧化石墨烯；检测；指数富集的配体系统进化技术；适配体传感器

适配体(aptamer)是一类能与靶物质高亲和力和特异性结合的随机寡核苷酸链，它通过SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，指数富集的配体系统进化)技术从大容量的随机文库中筛选得到，自从1990年适配体第一次被提出后，已得到了快速发展并应用于基础研究、诊断、治疗等多个领域[1-2]。适配体的特性包括适用靶物质范围广、亲和力高、特异性强、免疫原性低、易于修饰且不丢失活性、生产容易、价格低廉等。因此，适配体与抗体相比具有诸多优势，很有可能在不久的将来成为抗体的替代物。

石墨烯(graphene)最早于2004年由Novoselov等[3]报道，之后因其独特的二维结构和理化性质引起了科学家的广泛关注，包括双倍的外表面积，良好的化学稳定性、机械强度、导热性、导电性以及光透性等。氧化石墨烯(graphene oxide，GO)是石墨烯的氧化形式，它不仅保留了石墨烯的层状结构，同时因为氧基官能团的引入而获得了与石墨烯不同的性质，呈现出聚合物、胶体、薄膜以及两性分子等诸多特性。不同于石墨烯，GO具有水溶性并且易于大规模合成；另一个特性是它的π-π键分子吸附作用，表现出对适配体的高亲和力。在适配体应用方面，GO可以作为一种优秀的荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)的接收器。基于上述优良性质，使得GO成为适配体领域研究的热门材料[4-5]。

1 氧化石墨烯与适配体在检测方面的应用

GO在适配体检测中的应用包括多种方式。传统方法是直接通过物理或化学的方式将GO与适配体结合。GO可以通过物理吸附作用将适配体固定在其表面，从而提供一个检测的平台。当适配体与靶物质特异结合时，适配体从GO表面解离，进而通过检测这一变化来对靶物质进行检测。也有研究报道了通过共价键将GO与适配体结合的方法[6]，这一方法较之物理吸附，能更好地抵抗蛋白的非特异性吸附。而目前较前沿的方法是将GO与适配体以及其他材料结合形成复合物，包括适配体-纳米金-杂交氧化石墨烯复合物(Apt-AuNPs-GO)[7]、氯高铁血红素功能化的还原氧化石墨烯复合物(hemin-rGO)[8]、中空二氧化钛纳米球-三维还原氧化石墨烯-聚吡咯(TiO2/3D-rGO/PPy)纳米复合物[9]等。通过不同材料间的相互组合，使得适配体复合物具有不同的理化性质，从而达到更好的检测效果。

目前基于GO的适配体检测方法主要包括以下几种：荧光检测法[10-14]、电化学法[15-17]、比色法[8]等。荧光检测法是将适配体进行荧光基团修饰，在适配体与靶物质结合后，通过检测荧光强度来反映靶物质的含量；或者利用GO的荧光淬灭效应，当适配体与靶物质结合时，适配体与GO解离，荧光恢复，通过荧光信号的变化来对靶物质进行检测。电化学法是通过适配体将靶物质捕捉到电极界面，从而形成一种障碍阻碍电子转移，通过检测这一电信号的变化来间接检测靶物质的含量。比色法则是通过某种化学反应使溶液呈现一定颜色，而当适配体与靶物质结合时阻碍了这一反应的进行，使溶液呈现与之前不同的颜色，通过检测溶液色差变化进行靶物质的检测。

基于适配体适用靶物质范围广的特点，目前GO在适配体检测领域的应用主要包括以下3个方面：

1.1 小分子及金属离子检测 对氯霉素的检测与定量能够减少食品安全的风险，Alibolandi等[18]报道了一种基于QDs-Apt的“turn-on”适配体与GO的复合物用于氯霉素的检测，基于适配体与氯霉素的特异结合让能量在QDs-Apt与GO间转移的原理，使得荧光相应淬灭与恢复，从而检测氯霉素的含量。该适配体传感器具有98 pM的最低检出限和987 pM的最低定量限，同时对氯霉素表现出极高的选择性，而且对实际牛奶样品中的氯霉素也能达到0.2 ppb的检测极限。

啶虫脒是一种常用的杀虫剂。Yang等[8]报道了一种氯高铁血红素功能化的还原氧化石墨烯(hemin-rGO)适配体传感器用于啶虫脒的比色法检测。hemin-rGO复合物兼具rGO的物理吸附适配体的能力和氯高铁血红素的过氧化物酶样活性，可以在H202中催化TMB，从而使溶液呈现蓝色。当溶液中的啶虫脒的量越多时，吸附于hemin-rGO表面的自由适配体越少，离心后的上清液呈现出低吸光度的淡蓝色。这种与啶虫脒浓度相关的色差能被裸眼识别，也能被紫外分光仪检测。这种方法对啶虫脒的检测范围为100nM～10 μM，最低检出限为40 nM (S/n=3)，而且具有操作简便、价格低廉等优势，具有广阔的应用前景。

目前对生物体内与生态环境中的铅离子进行检测依然是一个挑战。Qian等[19]制备了一种荧光开启的检测铅离子的纳米传感器。这种适配体传感器能高特异性可重复地从其他离子中检测出Pb2+离子，并且这种检测方法仅需1 min左右的反应时间，最低检出限可达0.6 nM。

双酚A(BPA)是一种环境激素。Zhu等[20]报道了一种荧光共振能量转移(FRET)检测双酚A的方法。在不同的BPA浓度下，BPA引起适配体构象的改变，进而改变荧光修饰的适配体与GO的相互作用，导致荧光信号的改变。该方法的检测范围为0.1～10 ng/mL，最低检出限为0.05 ng/mL。另外，这一方法对BPA类似物无交叉反应，在实际样品中的重复率为96.0%～104.5%。

1.2 生物大分子检测 Xu等[21]发展了一种非标记的三螺旋结构适配体(THA)作为检测平台，起到“信号开关”的作用，用于凝血酶的荧光检测。此方法利用了THA作为信号转换器和GO作为荧光猝灭器，在保证对凝血酶的高特异性与敏感性的同时，检测范围为5～1200 nM，最低检出限为1.8 nM(S/n=3)。考虑到THA的同源多样性，这种适配体传感器可以作为一种用于THA同源性物质的荧光检测平台。

Wang等[9]报道了一种基于中空二氧化钛纳米球-三维还原氧化石墨烯-聚吡咯(TiO2/3D-rGO/PPy)纳米复合物的适配体传感器用于溶菌酶的检测。通过电化学微分脉冲伏安法，得出该传感器对溶菌酶的最低检出限为0.085 ng/mL(5.5 pM)，检测范围为0.1～50 ng/mL(0.007～3.5 nM)。这种适配体传感器同样表现出对溶菌酶的高特异性，不受其他共存蛋白的干扰。这种传感器提供了一种快速、高选择性、高敏感性检测溶菌酶的方法，同时也表明TiO2/3D-rGO/PPy纳米复合物能够作为一种生物医药领域的检测蛋白的电化学生物传感器。

Zhou等[22]提出了一种新的检测癌胚抗原的方法，基于适配体-GO并通过毛细管电泳-化学发光法检测。荧光强度与CEA浓度在0.0654～6.54 ng/mL之间存在线性关系，最低检出限为4.8pg/mL(S/n=3)。

1.3 微生物和细胞检测 目前，氧化石墨烯与适配体应用于细胞水平的检测主要集中于病原微生物和肿瘤细胞2个领域。

病原微生物方面，目前已报道了针对沙门氏菌[23]和金黄色葡萄球菌[24]的检测方法。前者采用了以GO和纳米金颗粒为主要介质的电化学传感器，通过检测电化学阻抗光谱来对沙门氏菌定量，其最低检出限为3 cfu/mL；后者以石墨烯为转导层，适配体为感应层，并用氧化石墨烯作为整个传感器的空间构架，所制成的电势适配体传感器不仅最低检出限可达1 cfu/mL，同时能够保证高选择性。这2种检测方法与传统方法相比具有低检测限和快速检测等优势，有望成为病原微生物检测的新方法。

血液中的循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)由于其表达多种标志物，一种CTC标志物不足以捕获血液中所有的CTC，因此高特异性敏感性地捕获和识别CTC目前依然存在诸多挑战。对此，Viraka Nellore等[25]报道了一种从血液中高效捕获和精确识别多种类型的CTC的方法，使用了一种适配体修饰的多孔渗水的GO膜。该方法将荧光修饰的S6、A9和YJ-1适配体吸附于20～40 μm多孔GO膜上，并且成功从患者血液中同时且高选择性地捕获到了多种肿瘤细胞(SKBR3乳腺癌细胞，LNCaP前列腺癌细胞，SW-948结肠癌细胞)。对于多种肿瘤细胞，捕获效率约为95%；对于一种肿瘤细胞，最低检出限为每毫升10个细胞。这一细胞检测技术对于一些目前依赖于细胞捕获技术进行早期诊断的疾病来说具有潜在的应用价值。

2 展望

基于氧化石墨烯各种独特的理化性质，它作为一种新材料在适配体的研究方面具有巨大的应用价值。然而，氧化石墨烯的应用依然有很多问题尚待解决。如何避免检测结果假阳性，并进一步提高适配体复合物的特异性与敏感性？如何降低现有的检测手段的成本问题？如何发展更为高效、价廉、便捷的检测方法？另外，如果要将适配体复合物应用于人体，它是否具有潜在的不良反应？如何解决上述问题将成为氧化石墨烯在适配体检测方面未来的研究方向。

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(编校：王俨俨)

Application progress of graphene oxide and aptamer in detection

LIN Yan-feng1, LIU Yu-yang1, GAO Shun-xiang2, WANG Liang-hua2, HU Bo2Δ

(1.Cadet Brigade, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China; 2.Marine Bio-pharmaceutical Institute, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)

Aptamers are oligonucleotides which can combine targets with high affinity and specificity.Graphene oxide is a kind of new material with many unique physical and chemical properties.Recently, graphene oxide is gradually applied to the field of aptamers and has made a series of progress.This review focused on the application progress of graphene oxide and aptamers in the detection of different targets including small molecules and metal ion, biomacromolecules and cells in order to provide references for the mass application of graphene oxide and aptamers in the field of detection.

aptamer; graphene oxide; detection; systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX); aptasensor

国家高技术研究发展计划(863计划)(2013AA092900)

林彦锋，男，本科，研究方向：生物化学与分子生物学，E-mail：601263186@qq.com；胡波，通讯作者，男，硕士，讲师，研究方向：生物化学与分子生物学，E-mail：hb8601@163.com。

Q503

A

1005-1678(2015)08-0186-03