共刺激分子在原发性胆汁淤积性肝硬化中的研究进展

季蓉，徐婷，吴敏

·综述·

共刺激分子在原发性胆汁淤积性肝硬化中的研究进展

季蓉，徐婷，吴敏

原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）是一种慢性渐进性自身免疫性肝病，特征是汇管区淋巴细胞浸润和胆管上皮细胞的选择性破坏［1-3］。90%～95% PBC 患者血清中都会出现高低度抗线粒体抗体（anti-mitochondrial antibody，AMA）阳性。PBC 病因不明，可能是环境、免疫紊乱、遗传变异等多种因素共同作用的结果。研究表明PBC 的发生与 T 细胞的异常活化有关。原始 T 细胞的活化不仅需要 TCR/CD3 复合物与主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）I、II 类分子的相互作用和识别，还需要共刺激分子的共同参与。共刺激分子是指参与免疫反应的辅助分子，存在于 T、B 淋巴细胞、抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）表面。共刺激信号在免疫应答中起着极其重要的作用，是决定受到抗原刺激的 T 细胞有效激发、适度效应和适时终止的关键因素。PBC 的发病机制主要是自身反应性 T 细胞的过度免疫反应。因此，控制自身反应性 T 细胞的活化和效应功能成为PBC 重要的潜在治疗靶点。现就共刺激分子 CD28/B7、CTLA-4/B7、PD-1/PD-L1、PD-L2 在 PBC 的免疫发病机制和相关治疗综述如下。

1 CD28/B7 和 CTLA-4/B7

1.1 CD28、CTLA-4、B7-1、B7-2 的分子结构

CD28 是大小为 44 kD 的 I 跨膜糖蛋白，是由二硫键连接而成的二聚体，属于免疫球蛋白超家族成员，所有的CD4+T 细胞和约 50% 的 CD8+T 细胞都可以被诱导表达CD28。T 细胞活化后其表达量迅速增加，并诱导其他共刺激分子的表达。细胞毒 T 淋巴细胞相关抗原 4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）也是免疫球蛋白超家族成员，与 CD28 在基因序列上有 70% 的同源性。但 CTLA-4 的表达范围较窄，仅表达于活化的 CD4+T、CD8+T 细胞上。CD28 和 CTLA-4 与 APC 表面的天然配体 B7-1 和 B7-2 是目前最重要的共刺激分子。B7-1 是大小为 44～60 kD 的免疫球蛋白超家族成员，有典型的 I 型膜蛋白特征。它主要以二聚体的形式表达于活化的 B 细胞、单核细胞、树突状细胞（dendritic cells，DC）、巨噬细胞和 T 细胞表面。B7-2 是大小为 75～115 kD 细胞表面糖蛋白，与 B7-1 在氨基酸序列上有 25% 的同源性，B7-2 多以单体的形式表达于静止的单核细胞、活化的 B 细胞、单核细胞、DC、自然杀伤细胞，巨噬细胞和 T 细胞表面。CTLA-4、CD28 与 B7 均互为受体配体。虽然 CTLA-4 的表达量不到 CD28 的 3%，但 CTLA-4 与 B7 的结合力却可以达到 CD28 与 B7 结合力的 20 倍。两者在 T 细胞免疫应答中的作用完全相反，CTLA-4 主要诱导 T 细胞的活化和增殖，CD28 则主要起抑制 T 细胞免疫应答的作用。

1.2 CD28/B7 和 CTLA-4/B7 的生物学功能

1.2.1 CD28/B7 的生物学功能 CD28/B7 提供 T 细胞活化的正性调节信号，CD28/B7 分子通过各种途径参与了T 细胞的反应：①加强 TCR/CD3 复合物与 APC 之间黏附和相互作用，诱导 T 细胞的活化和增殖；②诱导 IL-2、IFN-γ 等多种细胞因子表达及其 mRNA 的稳定，间接诱导细胞分裂周期抑制因子 p27 的降解和 G1-激酶的表达等，从而促进 T 细胞活化［4］；③促进 CTLA-4、ICOS、OX40、4-1BB 等共刺激分子的表达，从而促进T 细胞亚群的分化和增殖［5］；④阻止 T 细胞无反应并诱导短链细胞凋亡抑制蛋白（c-FLIPs）和抗凋亡蛋白 Bcl-xL、Bcl-2 等的产生，从而调节 Fas/fasL 介导 T 细胞的凋亡［5］。

1.2.2 CTLA-4/B7 的生物学功能 CTLA-4/B7 提供 T 细胞活化的负性信号。研究发现 CTLA-4 缺陷性小鼠中 T、B 淋巴细胞大量增殖，血清免疫球蛋白浓度增高，说明CTLA-4/B7 在抑制 T 细胞活化和维持免疫自稳状态中具有重要作用［6-7］，在 T 细胞活化过程中，CTLA-4 的作用机制是：①CTLA-4 可以下调整个 T 细胞群的增殖和细胞因子合成，起到抑制免疫应答的作用［8］。②CTLA-4 可以与 B7分子结合，从而抑制吲哚胺 2、3-加氧酶（idoleamine 2，3-dioxygenase，IDO），IDO 可以大量分解 T 细胞增殖分化所必需的氨基酸如色氨酸等，间接抑制了 T 细胞活化［9］。③CTLA-4 还通过调节 T 细胞来抑制免疫应答反应［10］。

1.3 CD28/B7 和 CTLA-4/B7 在 PBC 中的研究现况

1.3.1 CD28/B7 与 PBC PBC 血清中 AMA 可识别 2-氧酸脱氢酶复合体，特别是位于线粒体内膜的丙酮酸脱氢酶E2（PDC-E2）。PBC 的主要靶组织是肝内小胆管，可见胆管周围浆细胞浸润和胆管上皮细胞（biliary duct epithelial cells，BDEC）损伤和抗 PDC-E2 的 T 细胞在 BDEC 上异常表达。Kamihira 等［11］研究发现在 PBC 患者外周血和肝脏组织中可见抗 PDC-E2 的 CD4+CD28-T 细胞显著增加。这些 CD28-T 细胞主要通过以下途径影响 PBC 疾病的进展：①CD4+CD28-T 细胞可以使 Bcl-2 表达增高并抑制Bcl-2 的凋亡［12］。此外，它还可以表达具有细胞毒作用的穿孔素、颗粒酶 B［13］及分泌具有细胞杀伤作用的 IFN-γ［14-15］。②Isse 等［16］研究发现 PBC 患者小叶间 BDEC 中的CD4+CD28-T 细胞能克隆扩增自身反应性 T 细胞，最终导致 PBC 患者 BDEC 的损伤。

Tsuneyama 等［17］发现在 PBC 早期阶段，胆管周围几乎所有浸润性 T 细胞表面均表达 CD28 及 B7-2。通过 DC和坏死 BDEC 中的 B7-2 和T 细胞上的 CD28 的相互作用激活 Th 细胞，从而分泌特异性的细胞因子［18］。以上研究均证实 CD28/B7 共刺激信号途径在 PBC 发病机制中具有重要意义。

1.3.2 CTLA-4/B7 与 PBC Li 等［19］发现 CTLA4 基因的 rs231775 的 G 等位基因和 rs231725 的 A 等位基因与 PBC 的危险度显著相关，携带 rs3087243 的 A 等位基因患者比携带相同片段 G 等位基因的患者有着更好的生活质量。sCTLA-4 是 CTLA-4mRNA 选择性剪接外显子 3导致半胱氨酸残基的缺失的一种水溶性单体蛋白［20-22］。在自身免疫性甲状腺疾病、I 型糖尿病、SSc、SLE 和 MG 患者血清中检测到高浓度的 sCTLA-4，sCTLA-4 被认为是自身免疫性疾病的新的标记物［23］。Saverino 等［24］发现在 AMA阳性的 PBC 患者血清中可以检测到 sCTLA-4。由此，我们推测 CTLA 基因的缺失干扰了 CTLA-4 蛋白的表达和功能，从而阻止 T 细胞活化抑制信号的传递。

研究表明，CTLA-4Ig 能有效地抑制 CD8+T 细胞增殖活化并阻断 CD28/B7 信号通路［25］。Tanaka 等［26］构建了一个小鼠 PBC 的模型，小鼠表达的 TGF-β 受体（dnTGF-βRII）可促进 CTLA-4Ig 的分泌，结果发现 CTLA-4Ig 可以阻止诱导成 PBC 的小鼠的肝脏炎症反应和 T 细胞的活化。因此 CTLA-4Ig 有望成为 PBC 的新的治疗手段。

2 PD-1/PD-L1、PD-L2

2.1 PD-1/PD-L1、PD-L2 的分子结构

PD-1（programmed death-1）是一个大小为 55 kD 的I 型跨膜糖蛋白，属于 CD28 免疫球蛋白超家族新成员，它包含一个 IgV 结构域和一个含有 97 个氨基酸的胞质尾，其胞质尾包含一个免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM）和一个免疫受体酪氨酸转化基序（ITSM）［27］。PD-1 主要表达在活化的 T 细胞、B细胞髓系细胞和胸腺细胞上［28］。PD-1 有 2 个配体 PD-L1 和 PD-L2，两者均属于 I 型跨膜糖蛋白，两种配体有 40% 的氨基酸序列相同，且均有IgC 与 IgV 型结构域、跨膜区和一个短而保守的胞浆区尾部。PD-L1 除了在大多数淋巴细胞上表达，还可以广泛地表达于非淋巴样细胞如上皮细胞［29］、内皮细胞［30］和各种肿瘤细胞［31-32］上。相反，B7-DC 表达的限制在巨噬细胞和树突状细胞上［33］。PD-1/PD-L1、PD-L2 在介导负性共刺激信号，抑制自身反应性 T 细胞和维持免疫耐受中发挥重要作用，也成为肿瘤免疫、移植免疫和自身免疫的研究热点［34-35］。

2.2 PD-1/PD-L1、L2 的生物学功能

PD-1 基因敲除的 C57BL/6PD-1/- 小鼠可出现狼疮样肾炎和关节炎［36］。而 PD-1 基因敲除的 BALB/cPD-1/- 小鼠可发展为扩张型心肌病［37］。这些结果表明，PD-1 及其配体在调节免疫耐受性和自身免疫性发挥重要作用。PD1/PD-L1、PD-L2 通过多种途径参与机体的免疫调节：①PD-1 分子的细胞内信号由 PI3K-Akt 通路主导［38］。PD-1 可以通过 ITIM和 ITSM 中的 α-氨基对羟丙酸残基进行传导磷酸化信号，它通过 Lyn 磷酸化使 BCR 与 PD-1 的 Fc 片段的交叉偶联更为紧密。此外，磷酸化的 ITSM 还可以产生去磷酸化作用，它通过 SH2 区域募集 SHP-2。SHP-2 又可使BCR 近端信号分子 Iga/b、Syk 去磷酸化，从而减弱下游分子 PLCg2、PI3K、vav 和 ERK1/2 的激活，由此抑制了B 细胞的活化［39］。PD-1/PD-L1、PD-L2 抑制 T 细胞受体、Toll 样受体及微生物表面的受体信号传递也是通过类似的通路。②PD-1/PD-L1、PD-L2 可以通过抑制自身反应性 T 细胞的活化和功能及促进 Foxp3+Treg 细胞的形成和功能，进而诱导机体的免疫耐受。③PD-L1 促进 TH2 型免疫应答及其细胞因子（IL-10 和 IL-4 等）的分泌，抑制 TH1 型免疫应答及其细胞因子（IL-2 和 IFN-γ 等）的分泌。④PD-1影响 T 细胞在胸腺发育过程进而影响外周 T 细胞库［40］。

2.3 PD-1/PD-L1、PD-L2 与 PBC

PD-1 可以表达在肝脏的库普弗细胞（Kupffer cells，KC）、其他单核细胞衍生的细胞、上皮细胞、内皮细胞及肿瘤细胞上［32，41-42］。Mataki 等［43］研究发现，PD-L1、PD-L2 可表达在肝脏的门脉区。PD-L1 主要表达在 KC、DC 及肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cells，LSEC）上，尤其在 LSEC 上表达特别强烈，而 PD-L2 只出现在 KC 和DC 上。肝内 PD-1 和 KC 及 LSEC 上的 PD-L1、PD-L2相互作用可以下调自身反应性 T 淋巴细胞从而引起 PBC的免疫失调［44］。实验中，他们还发现肝内表达的 PD-L1、PD-L2 受 IFN-γ 的调节，PBMCs 受到 IFN-γ 刺激后，PD-L1、PD-L2 的表达均会上升。因此我们可以通过调节IFN-γ 的分泌，从而达到控制 PD-L1、PD-L2 的表达及疾病进展的目的。

大量研究证实自身免疫性疾病的发生和发展与遗传相关。Juran 等［45］研究发现 PD-1 的 PD1.3A 等位基因会促进本身携带 CTLA4 49AG：CT60 AA 单倍型基因且 AMA 阳性的 PBC 患者疾病进一步进展。因此对 PBC 患者进行遗传性分析，我们就可以对 PBC进行早期诊断，病情评估以及选择合理的治疗方案。Chen 等［46］还发现 MSC 可以上调PD-L1 的表达从而抑制 IL-17 产生，这为我们治疗自身免疫性肝病提供了新的思路。

3 展望

综上所述，共刺激分子与 PBC 的发生、发展密切相关，但其机制仍有待深入研究，随着分子生物学科学技术以及相关学科的不断发展，科研与临床疾病之间日益增加的联系，我们还可能发现更多的共刺激分子，它们的分子结构、生物学功能以及与 PBC 之间的关系的研究将会有更大的进展，随着对 PBC 发病机制的不断深入研究，我们相信会为PBC 的诊断和治疗提供全新的视角和前景。

［1］ Hirschfield GM， Gershwin ME. The immunobiology and pathophysiology of primary biliary cirrhosis. Annu Rev Pathol， 2013，8：303-330.

［2］ Liaskou E， Hirschfield GM， Gershwin ME. Mechanisms of tissue injury in autoimmune liver diseases. Semin Immunopathol， 2014，36（5）：553-568.

［3］ Wang L， Wang FS， Chang C， et al. Breach of tolerance： primary biliary cirrhosis. Semin Liver Dis， 2014， 34（3）：297-317.

［4］ Huang F， Mo XA. Co-stimulatory molecules and myasthenia gravis. Neural Inj Funct Reconstr， 2007， 2（2）：85-89. （in Chinese）

黄芳， 莫雪安. 共刺激分子与重症肌无力. 神经损伤与功能重建，2007， 2（2）：85-89.

［5］ Kirchhoff S， Muller WW， Li-Weber M， et al. Up-regulation of c-FLIPshort and reduction of activation-induced cell death in CD28-costimulated human T cells. Eur J Immunol， 2000， 30（10）：2765-2774.

［6］ Waterhouse P， Penninger JM， Timms E， et al. Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in Ctla-4. Science， 1995，270（5238）：985-988.

［7］ Tivol EA， Borriello F， Schweitzer AN， et al. Loss of CTLA-4 leads to massive lymphoproliferation and fatal multiorgan tissue destruction，revealing a critical negative regulatory role of CTLA-4. Immunity，1995， 3（5）：541-547.

［8］ Krummel MF， Allison JP. CTLA-4 engagement inhibits IL-2 accumulation and cell cycle progression upon activation of resting T cells. J Exp Med， 1996， 183（6）：2533-2540.

［9］ Grohmann U， Orabona C， Fallarino F， et al. CTLA-4-Ig regulates tryptophan catabolism in vivo. Nat Immunol， 2002， 3（11）：1097-1101.

［10］ Takahashi T， Tagami T， Yamazaki S， et al. Immunologic self-tolerance maintained by CD25（+）CD4（+） regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J Exp Med，2000， 192（2）：303-310.

［11］ Kamihira T， Shimoda S， Harada K， et al. Distinct costimulation dependent and independent autoreactive T-cell clones in primary biliary cirrhosis. Gastroenterology， 2003， 125（5）：1379-1387.

［12］ Schirmer M， Vallejo AN， Weyand CM， et al. Resistance to apoptosis and elevated expression of Bcl-2 in clonally expanded CD4+CD28- T cells from rheumatoid arthritis patients. J Immunol， 1998， 161（2）：1018-1025.

［13］ Namekawa T， Wagner UG， Goronzy JJ， et al. Functional subsets of CD4 T cells in rheumatoid synovitis. Arthritis Rheum， 1998， 41（12）：2108-2116.

［14］ Namekawa T， Snyder MR， Yen JH， et al. Killer cell activating receptors function as costimulatory molecules on CD4+CD28null T cells clonally expanded in rheumatoid arthritis. J Immunol， 2000，165（2）：1138-1145.

［15］ Weyand CM， Klimiuk PA， Goronzy JJ. Heterogeneity of rheumatoid arthritis： from phenotypes to genotypes. Springer Semin Immunopathol， 1998， 20（1-2）：5-22.

［16］ Isse K， Harada K， Sato Y， et al. Characterization of biliary intra-epithelial lymphocytes at different anatomical levels of intrahepatic bile ducts under normal and pathological conditions：numbers of CD4+CD28- intra-epithelial lymphocytes are increased in primary biliary cirrhosis. Pathol Int， 2006， 56（1）：17-24.

［17］ Tsuneyama K， Harada K， Yasoshima M， et al. Expression of co-stimulatory factor B7-2 on the intrahepatic bile ducts in primary biliary cirrhosis and primary sclerosing cholangitis： an immunohistochemical study. J Pathol， 1998， 186（2）：126-130.

［18］ Lenschow DJ， Ho SC， Sattar H， et al. Differential effects of anti-B7-1 and anti-B7-2 monoclonal antibody treatment on the development of diabetes in the nonobese diabetic mouse. J Exp Med， 1995， 181（3）：1145-1155.

［19］ Li Q， Wang B， Pan F， et al. Association between cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 gene polymorphisms and primary biliary cirrhosis in Chinese population： data from a multicenter study. J Gastroenterol Hepatol， 2013， 28（8）：1397-1402.

［20］ Salomon B， Bluestone JA. Complexities of CD28/B7： CTLA-4 costimulatory pathways in autoimmunity and transplantation. Annu Rev Immunol， 2001， 19：225-252.

［21］ Magistrelli G， Jeannin P， Herbault N， et al. A soluble form of CTLA-4 generated by alternative splicing is expressed by nonstimulated human T cells. Eur J Immunol， 1999， 29（11）：3596-3602.

［22］ Oaks MK， Hallett KM. Cutting edge： a soluble form of CTLA-4 in patients with autoimmune thyroid disease. J Immunol， 2000， 164（10）：5015-5018.

［23］ Baehring JM， Damek D， Martin EC， et al. Neurolymphomatosis. Neuro Oncol， 2003， 5（2）：104-115.

［24］ Saverino D， Pesce G， Antola P， et al. High levels of soluble CTLA-4 are present in anti-mitochondrial antibody positive， but not in antibody negative patients with primary biliary cirrhosis. PLoS One， 2014，9（11）：e112509.

［25］ Suresh M， Whitmire JK， Harrington LE， et al. Role of CD28-B7 interactions in generation and maintenance of CD8 T cell memory. J Immunol， 2001， 167（10）：5565-5573.

［26］ Tanaka H， Yang GX， Tomiyama T， et al. Immunological potential of cytotoxic T lymphocyte antigen 4 immunoglobulin in murine autoimmune cholangitis. Clin Exp Immunol， 2015， 180（3）：371-382.

［27］ Okazaki T， Maeda A， Nishimura H， et al. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proc Natl Acad Sci U S A， 2001， 98（24）：13866-13871.

［28］ Linsley PS， Greene JL， Tan P， et al. Coexpression and functional cooperation of CTLA-4 and CD28 on activated T lymphocytes. J Exp Med， 1992， 176（6）：1595-1604.

［29］ Freeman GJ， Long AJ， Iwai Y， et al. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. J Exp Med， 2000，192（7）：1027-1034.

［30］ Iwai Y， Terawaki S， Ikegawa M， et al. PD-1 inhibits antiviral immunity at the effector phase in the liver. J Exp Med， 2003， 198（1）：39-50.

［31］ Iwai Y， Ishida M， Tanaka Y， et al. Involvement of PD-L1 on tumor cells in the escape from host immune system and tumor immunotherapy by PD-L1 blockade. Proc Natl Acad Sci U S A， 2002，99（19）：12293-12297.［32］ Dong H， Strome SE， Salomao DR， et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis： a potential mechanism of immune evasion. Nat Med， 2002， 8（8）：793-800.

［33］ Yamazaki T， Akiba H， Iwai H， et al. Expression of programmed death 1 ligands by murine T cells and APC. J Immunol， 2002， 169（10）：5538-5545.

［34］ Fife BT， Pauken KE. The role of the PD-1 pathway in autoimmunity and peripheral tolerance. Ann N Y Acad Sci， 2011， 1217：45-59.

［35］ Riella LV， Paterson AM， Sharpe AH， et al. Role of the PD-1 pathway in the immune response. Am J Transplant， 2012， 12（10）：2575-2587.

［36］ Nishimura H， Nose M， Hiai H， et al. Development of lupus-like autoimmune diseases by disruption of the PD-1 gene encoding an ITIM motif-carrying immunoreceptor. Immunity， 1999， 11（2）：141-151.

［37］ Nishimura H， Okazaki T， Tanaka Y， et al. Autoimmune dilated cardiomyopathy in PD-1 receptor-deficient mice. Science， 2001，291（5502）：319-322.

［38］ Subudhi SK， Zhou P， Yerian LM， et al. Local expression of B7-H1 promotes organ-specific autoimmunity and transplant rejection. J Clin Invest， 2004， 113（5）：694-700.

［39］ Chemnitz JM， Parry RV， Nichols KE， et al. SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation， but only receptor ligation prevents T cell activation. J Immunol， 2004， 173（2）：945-954.

［40］ Toda G， Zeniya M， Watanabe F， et al. Present status of autoimmune hepatitis in Japan--correlating the characteristics with international criteria in an area with a high rate of HCV infection. Japanese National Study Group of Autoimmune Hepatitis. J Hepatol， 1997，26（6）：1207-1212.

［41］ Brown JA， Dorfman DM， Ma FR， et al. Blockade of programmed death-1 ligands on dendritic cells enhances T cell activation and cytokine production. J Immunol， 2003， 170（3）：1257-1266.

［42］ Selenko-Gebauer N， Majdic O， Szekeres A， et al. B7-H1（programmed death-1 ligand） on dendritic cells is involved in the induction and maintenance of T cell anergy. J Immunol， 2003， 170（7）：3637-3644.

［43］ Mataki N， Kikuchi K， Kawai T， et al. Expression of PD-1， PD-L1， and PD-L2 in the liver in autoimmune liver diseases. Am J Gastroenterol，2007， 102（2）：302-312.

［44］ Oikawa T， Takahashi H， Ishikawa T， et al. Intrahepatic expression of the co-stimulatory molecules programmed death-1， and its ligands in autoimmune liver disease. Pathol Int， 2007， 57（8）：485-492.

［45］ Juran BD， Atkinson EJ， Schlicht EM， et al. Interacting alleles of the coinhibitory immunoreceptor genes cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 and programmed cell-death 1 influence risk and features of primary biliary cirrhosis. Hepatology， 2008， 47（2）：563-570.

［46］ Chen Y， Chen S， Liu LY， et al. Mesenchymal stem cells ameliorate experimental autoimmune hepatitis by activation of the programmed death 1 pathway. Immunol Lett， 2014， 162（2 Pt B）：222-228.

10.3969/j.issn.1673-713X.2015.06.015

江苏省常州市卫生局重大科技项目（ZD201108）；国家自然科学基金青年科学基金（K11245213）

213003 常州，苏州大学附属第三医院风湿免疫科

吴敏，Email：wuumin@163.com

2015-06-08