脑出血后死亡神经元标记方法的研究进展

靳 航，郭珍妮综述，吴 江，邢英琦，杨 弋审校

脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是脑卒中的一种亚型，其病死率和致残率均很高。到目前为止，人们对于脑出血的损伤机制知之甚少，而治疗方法更是乏善可陈。脑出血的研究大多是通过基础实验来进行，实验性脑出血模型的选择和建立对于研究脑出血的病理生理学过程和药物疗效方面至关重要，目前广泛应用于动物实验的两个脑出血模型为基底节自体血或胶原酶注射。选择基底节注射的原因是基底节(包括壳核，尾状核和丘脑)是ICH 最常见的部位［1］。以往的实验性脑出血研究中发现，脑组织中的血肿致使脑水肿的生成和神经元损伤。在血肿周边可以看到大量的细胞死亡，血肿导致神经细胞死亡的原因有:(1)血肿形成过程中对周边脑组织的机械压迫作用［1］;(2)血肿内红细胞裂解释放出的毒性成分，如铁离子和凝血酶，也是导致继发性脑损伤的重要原因［2］。脑出血后神经元死亡以坏死为主;另有研究表明出血后灶周组织细胞核内存在与NF-κB 表达相关的凋亡［3，4］;最近更有研究显示，自噬作为另一种程序性死亡方式，也存在于脑出血后灶周组织细胞内，成为脑出血后神经元死亡的第三种方式［5，6］。寻找能够准确反映血肿灶周细胞损伤和死亡的标志物对于实验性脑出血损伤机制的研究和治疗方法的评估至关重要。

目前有一些方法能够对血肿周边损伤脑组织进行描述，如一些常规的染色方法包括神经元核抗原染色，能够依据神经元细胞缺失来明确细胞变性死亡，但上述染色方法对变性细胞和正常形态细胞差异并不显著，很容易出现假阳性或假阴性［7］;还有一些新兴的用于特异性检测神经元损伤的染色方法，包括TUNEL 染色，用于明确DNA 损伤［8］;Fluoro-Jade染色，用于检测死亡神经元［9］;体内注射碘化丙啶(PI)，用于标记细胞膜受损的细胞，是一种活体示踪剂［10］，已应用于脑出血后灶周组织损伤的衡量。尽管这几种方法对于显示血肿灶周损伤均有很高的敏感性，但很难划定脑出血后血肿周围组织的损伤范围;近年来有报道，DARPP-32 是基底节GABA 能神经元的特异性标志物［11］，已有相关文献报道其能够准确标记出神经元受累的区域，对于实验性脑出血早期所致的基底节脑损伤的量化对于疾病的机制研究和治疗的评估均有重要的价值［12］。本文将就这些标记方法进行综述，并综合分析其优缺点，以期为实验性脑出血的研究工作提供帮助。

1 神经元核抗原(neuron-specific nuclear protein，NeuN)染色

Mullen 等于1992 年首次报道这种神经细胞标志蛋白［13］。NeuN 是一种可溶性核蛋白，表达在脊椎动物神经系统多数神经细胞中的特异性蛋白，在体外能够与成熟的神经元细胞核内DNA 结合，因此成为中枢神经系统和周围神经系统成熟神经元的标志物，被广泛应用于动物实验免疫组织化学染色中。NeuN 在免疫印迹分析中显示出3 个条带，分子量介于46～48 kD。在大鼠中，NeuN 阳性神经元广泛分布于大脑皮质、基底神经节、脊髓后角。其中，以皮质神经元的NeuN 免疫活性最强，而在小脑浦肯野细胞和嗅球则表达缺失。NeuN 在病理状态下脑内神经元中的免疫活性大幅下降，因此能够明确神经元缺失、死亡情况［14，15］。在脑出血的相关研究中，Zhao 等利用实验性SD 大鼠自体血注射模型在出血1 d、3 d 和7 d 后进行脑组织冰冻切片NeuN 免疫组织化学染色，结果发现在出血不同时间点，皆能在血肿灶周组织中发现NeuN 免疫缺失区域，即细胞死亡，选点计数NeuN阳性细胞即可定量分析脑出血灶周细胞死亡严重程度。该研究还通过计数NeuN 阳性细胞来评价铁螯合剂治疗脑出血的疗效，清晰明了［16］。但有学者认为NeuN 阴性不仅见于神经元缺失，还见于蛋白免疫原性缺失［17］。此外，NeuN 主要针对皮质神经元，而对基底节损伤细胞的显示欠佳，而大多数在体脑出血基础研究所选用的病变部位为基底节(高血压性脑出血的好发部位)，因此NeuN 作为脑出血灶周神经元死亡标记物的价值仍值得商榷。

2 Fluoro-Jade C(FJC)染色

目前用于变性神经元染色的FJ 染料分别有FJ、FJB 和FJC 三种，均由Schmued 及其团队分别在1997 年［18］，2000年［19］和2005 年［20］报道。FJB 和FJC 均为FJ 衍生而出。FJ是一种三价阴离子荧光素衍生物，分子量为445D。FJ 的发射峰为550 nm，激发峰值分别在362 nm 和390 nm。FJ 染料对变性神经元具有很高亲和力，在紫外线照射下，变性神经元呈现绿色荧光。与传统的染色方法相比，FJ 染色可清晰标记脑及脊髓组织切片上变性神经元的胞体、树突和轴突。FJ显示变性神经元的原理到目前为止仍不明确，可能变性的神经元分泌碱性分子，与酸性的FJ 染料有很强的亲和力，进而结合显色。研究者发现，FJB 和FJC 与FJ 相比，染色时间更短，所需染料的有效浓度更低，背景色更浅，与变性神经元的亲和力更高，其中以FJC 的表现更为出色［20］。在脑出血的相关实验研究中，Zhao 等利用SD 大鼠自体血注射模型在出血后1 d 分别对出血组和治疗组进行脑组织冰冻切片FJC 染色，通过对出血灶周FJC 阳性细胞进行计数，明确灶周细胞变性死亡情况及治疗效果［16］。Wu 等利用自发高血压大鼠(SHR)自体血注射，切片后FJC 染色也能够清晰显示血肿灶周变性的神经元，在SHR 大鼠血肿的周边FJC 染色阳性细胞数量大于对照组［21］;同样，FJC 染色还应用到猪自体血注射脑出血灶周细胞损伤的检测［22］。FJC 在脑出血灶周变性细胞显示方面也有不足之处，虽然能够在高倍镜下较好显示出血灶周变性坏死的神经元，但无法从整体去评估损伤的范围和程度;此外，与染色方法有关，FJC 与其他抗体同时进行免疫荧光双染的效果相对较差。

3 DNA 损伤检测

脑出血与氧化损伤的关系首先在2000 年由Hall 等阐述［23］。氧化损伤通过多种途径损伤脑组织，其中一个重要的途径即直接DNA 损伤。与DNA 损伤和细胞死亡的关系明确。DNA 单链的损伤是通过裸露末端利用DNA 聚合酶Ⅰ介导的生物素标记的dATP 缺口平移(DNA polymerase mediated biotin-dATP nick-translation，PANT)染色法检测;DNA 双链的损伤是通过末端脱氧核营酸转移酶介导的dUTP 末端标记(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)进行检测。Wu 等已在2002 年在实验性大鼠裂解红细胞基底节内注射模型中证实出血后血肿内红细胞降解，导致周围组织细胞内出现氧化损伤，过氧化物歧化酶(Mn-SOD，Cu/Zn-SOD)水平明显下降［24］。在灶周组织切片染色中，PANT 阳性细胞在裂解红细胞注射后1 d 开始出现，2 d 达到高峰;而TUNEL 阳性细胞在注射后2～3 d 才开始出现，晚于PANT 染色，而在假手术组未发现两种染色阳性细胞。认为氧自由基能够直接损伤DNA，DNA 单链损伤在游离铁离子的参与下被进一步加重，但单链损伤易于被修复。DNA 双联损伤则多被认为是凋亡的标志［25］。在铁离子导致脑组织损伤的研究中，TUNEL、PANT 连同FJC 一起用于明确灶周细胞变性死亡情况及铁螯合剂治疗效果［16］。TUNEL 及PANT 染色用于显示DNA 损伤，而DNA 具有自我修复功能，因而可能会出现假阳性的结果;同样与染色方法有关，TUNEL 及PANT 与其他抗体同时进行免疫荧光双染定性的效果相对较差。

4 碘化吡啶(propidium iodide，PI)体内注射

PI 是一种溴化乙啶的类似物，它在嵌入双链DNA 后释放红色荧光。PI 不能通过完整的细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。因此PI 经常被用来与Calcein，AM 等荧光标记物一起使用，能同时在体外实验中对活细胞和死细胞进行染色。PI-DNA 复合物的激发和发射波长分别为568nm和585nm。近年来，研究人员利用PI 来标记坏死细胞。当细胞膜破裂后，PI 进入细胞显示红色荧光，目前已经应用于脑缺血，脑出血和脑外伤模型中［10，26，27］。在脑出血的相关研究中，利用小鼠基底节胶原酶注射脑出血模型，通过静脉或者腹腔内注射PI(1 μg/g 体重)，在不同时间点处死避光取脑切片后直接置于荧光显微镜下观察脑出血血肿周边组织内细胞死亡情况，同样，也可以与其他颜色荧光抗体进行免疫荧光染色，确定死亡细胞的类型(神经元、星型胶质细胞或小胶质细胞)和细胞死亡方式(坏死:PI +/TUNEL-;凋亡:PI-/TUNEL+;其他死亡类型:PI +/TUNEL +)［10］。在另一研究中，利用大鼠基底节自体血注射模型，PI(50 mg/ml，2 μl)与自体血100 μl 预混后脑内注射，3 d 后处死避光切片在荧光显微镜下同样能够在血肿周边找到大量PI 阳性细胞［12］。该方法的缺点在于操作过程需全程避光，荧光易淬灭，另外实验过程中需排除PI 本身对脑组织的损害。

5 DARPP-32 免疫荧光染色

前面4 部分围绕脑出血血肿周边细胞死亡的判定和计数，量化方法均需高倍镜在血肿周围取点计数，很难对血肿灶周组织整体的损伤情况进行评估。在最近的研究中，发现DARPP-32 已经被用作反映基底节损伤的神经元标志物［11，28］。DARPP-32 蛋白是一个简单且可以量化的指标，能够在量化脑出血所致基底节神经元死亡中发挥重要作用［12］。

DARPP-32 (Dopamine-and cAMP-regulated phosphoprotein，Mr 32 kDa)最早是在1983 年由Ivar Walaas 发现的，它是一个胞内活性蛋白，存在于基底节中等大小棘神经元内，是多巴胺活化腺苷酸环化酶的一个重要靶点［29～32］，而纹状体是大鼠基底节的主要组成成分［33］。纹状体中标记DARPP-32 蛋白的中型棘神经元占纹状体细胞的95%以上。在超微结构方面，DARPP-32 存在几乎所有亚细胞结构中，广泛分布于细胞浆和轴突中［29］。研究血肿灶周组织损伤程度由DARPP-32 免疫荧光阴性区域和血肿之差来表示，在大鼠接受实验性脑出血模型后，脑组织损伤从术后1 d 开始出现，3 d 到高峰，14 d 则明显下降。DARPP-32 免疫印迹分析结果支持上述结果。在对PI 标记的切片进行DARPP-32 染色后在荧光显微镜下观察，发现二者所发射的荧光信号并无重合，血肿周围为大量红色PI 阳性细胞，而DARPP-32 则为阴性;而外围DARRPP-32 阳性区域内同样找不到PI 阳性细胞，表明在基底节DARPP-32 荧光阴性区域能够准确代表神经元死亡范围。去铁敏(DFX)是一种铁螯合剂，在以前研究中证明其能够减轻脑出血所致的脑损伤［22，34］。该研究还利用DARPP-32 染色再一次验证了铁螯合剂对实验性脑出血的治疗作用(与对照组相比，治疗组DARPP-32 阳性区域显著扩大)。研究者发现，通过免疫印迹分析，DARPP-32 表现为位于32kDa 的一条清晰的条带。对其进行组间像素的差异计算，可对脑出血后细胞损伤进行半定量分析。作为一种全新的方法，对于DARPP-32 在脑出血后基底节细胞死亡定量的价值尚需进一步研究支持。

6 结语

寻找能够准确反映血肿灶周细胞损伤和死亡的标志物对于实验性脑出血损伤机制的研究和治疗方法的评估至关重要。一种准确、可靠的衡量出血灶周细胞死亡的方法需要具备灵敏度和特异性均高、操作方便、稳定性好等特点。在研究实践中，需要综合分析各种染色方法的优缺点，以期为实验性脑出血的研究工作提供帮助。

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