微小RNA与炎症相关心血管疾病的研究进展

吴晓燕 商洪才 苗琳 樊官伟

作者单位：300193天津中医药大学（吴晓燕、苗琳、樊官伟）；北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部重点实验室和北京市重点实验室（商洪才）

微小RNA（microRNA，miRNA）是一类进化上高度保守，长度约18～22个核苷酸的不编码蛋白质的单链小分子RNA，能够通过与靶mRNA特异性的碱基配对引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译，从而对基因进行转录后表达的调控[1]。炎症是具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御反应。近年，心血管疾病发病率和死亡率呈上升趋势，严重威胁人类的生命健康。已知多种心血管疾病都与炎症反应有关，而炎症与miRNA之间又存在不可忽视的联系，因此本文就近年来miRNA与炎症相关心血管疾病的研究进展进行综述，旨在更好理解并利用miRNA进行疾病的诊疗。

1 miRNA的简介

1.1 miRNA的发现和发展

1993年，第一个miRNA基因（lin-4）于Lee等[2]在研究秀丽小杆线虫发育缺陷时发现，观察到它能在时序上调控线虫胚胎后期发育的基因。秀丽小杆线虫的异时性基因lin-4不编码蛋白质，其转录产物中有一个长度为22 nt的RNA。该转录产物在幼虫一期的后期表达，与lin-14的mRNA 3′端非翻译区上7段保守的靶位部分互补结合后，能短暂下调lin-14蛋白质的表达水平，使线虫实现由幼虫一期向二期的转化。随之，Reinhart等[3]发现另一能促进幼虫向成虫转变的let-7基因，其转录产物为21 nt的RNA。该发现使miRNA得到了应有的重视并迅速成为研究热点。到目前为止，已在线虫、果蝇及人类组织中发现了2 000多种此类非编码小RNA（www.mirbase.org），它们被统一称为 miRNAs[4]。 已报道的miRNAs都具有非常重要的生物学功能，参与调控真核生物约30% ～50%基因的表达，参与细胞增殖、凋亡等生理过程[5]。

1.2 miRNA的合成路径及作用机制

miRNA的生物合成过程已经得到了初步的诠释。其过程共分3步：首先细胞核中的miRNA基因生成有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴的原始转录片段（primary miRNA transcription，pri-miRNAs）；然后经 RNA内切酶Ⅲ家族的RNase Drosha酶剪切及一系列复杂的过程，生成70nt的带发夹结构的前体转录本（precursor miRNA transcription，premiRNAs）[4]；最后 pre-miRNAs在 Ran-GTP 依赖的 Exportin5的协助下以异三聚体形式被转运到细胞质，在此它们被RNase Dicer酶进一步切割成长度为18～22 nt的双链miRNA[6]。双链miRNA中的一条链被降解，另一条成为成熟的miRNA后，与多种蛋白组合成RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），执行靶 mRNA 的降解或者翻译抑制[4]的功能。

miRNA发挥作用的方式可分为两种：一种是通过与靶mRNA的3′非翻译区互补配对，指导miRNA切割、降解靶mRNA（切割与降解的平衡取决于miRNA与靶mRNA的互补程度）[7]；另一种调控机制称为翻译抑制[4]，此方式不影响mRNA的水平，却可降低相应蛋白表达的水平（生物体内miRNA对靶基因的调控主要采用这种方式）。

2 miRNA与炎症及心血管疾病的关系

近年来发现与炎症相关的心血管疾病主要有高血压、动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）和心肌缺血等，而糖尿病是心血管疾病的主要危险因素。心血管疾病是一种慢性炎症和自身免疫性疾病。AS的炎症学说已得到广泛的认可，也有学者将糖尿病视为一种先天性免疫性疾病。miRNA在这些疾病的病程进展中都具有调节作用。

2.1 miR-146a

近年来研究较广泛的miRNA之一是miRNA-146（miR-146a和 miR-146b）。人类 mir-146a定位于第5号染色体LOC285628基因上，其成熟序列位于第二外显子上[8]。miR-146的序列在不同物种间高度保守，提示其在生物体的炎症、免疫过程中可能发挥重要的作用。

Taganov等[9]于MD2细胞系中发现miR-146a的启动子区有一核因子κB（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB）的结合位点，而 NF-κB 对于炎症发生发展具有重要调控作用，推测miR-146a可能通过与NF-κB通路形成负反馈调节对炎症发挥调节作用。该研究组通过微阵列分析发现，THP-1细胞经细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激后 miRNA-146a 的表达明显升高，并且通过突变和荧光素酶报告基因实验证实，miRNA-146a的靶基因是 Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）/NF-κB信号通路中的两个重要基因，即 IRAK1和 TRAF6。miR-146a表达升高可使IRAK1和TRAF6的表达均下调。

氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，oxLDL）在巨噬细胞中的聚集是AS的一个重要病理过程。Yang等[10]发现，给予oxLDL后巨噬细胞中miR-146a水平下降，miR-146a显著降低巨噬细胞中低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）、白介素 6（interleukin-6，IL-6）、白介素8（interleukin-8，IL-8）和基质金属蛋白酶 9（Matrix metallopeptidase 9，MMP-9）的表达，过表达的 miR-146a通过负反馈调控TLR4信号通路抑制AS的形成。该研究表明miR-146a参与AS的发生发展。

2.2 miR-155

miR-155是另一热点多功能miRNA，其基因位于人类21号染色体B细胞融合集群基因的第3个外显子内，miR-155在调节免疫、炎症和心血管疾病的发生发展过程中具有重要作用。

Taganov等[9]实验发现，THP-1细胞经LPS刺激后，类似于miRNA-146a，miR-155的表达也被诱导升高。其诱导途径为LPS-TLR4-NF-κB通路，中间通过MyD88或 TRIF信号途径使NF-κB活化，后者与miR-155基因的启动子直接结合，上调miR-155表达，进而诱导炎症因子如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的释放[11]。 反过来，TNF-α等炎症因子也可诱导miR-155表达上调。此外，miR-155可以通过靶向结合TRAF6的下游信号分子TAB2[12]，抑制NF-κB的激活，也可作用于SHIP1等发挥负性调节作用，防止过度的炎症反应导致其他炎症性疾病。

miR-155在成年自发性高血压大鼠主动脉中的表达显著降低，提示该miRNA可能与高血压的发生发展相关。Ceolotto等[13]发现，miR-155的靶基因之一为血管紧张素Ⅱ1型受体（angiotensin type 1 receptor，AT1）基因，miR-155 作用于该基因可下调AT1的表达，因而miR-l55可参与血压的调节。

2.3 miR-126

miR-126的基因位于人类第9号染色体表皮生长因子样结构域7（epidermal growth factor like domain 7，EGFL7）基因的第7内含子中，与EGFL7基因共表达。因为EGFL7基因主要表达于血管内皮细胞，因此miR-126被认为是血管内皮细胞特异性的miRNA[14]。

由于内皮细胞参与构成AS病灶，提示miR-126对炎症相关的AS起调节作用。miR-126的靶基因之一是血管细胞黏附分子 1（vascular cell adhesion molecular 1，ⅤCAM-1）。Harris等[15]通过实验敲低了内皮细胞中内源性miR-126后，发现TNF-α诱导的ⅤCAM-1表达上调，白细胞向内皮细胞黏附增加。而当miR-126表达水平增加时，ⅤCAM-1的表达下调。白细胞向内皮细胞黏附现象是AS的一个重要病理过程，推测通过靶向增加miR-126表达可抑制ⅤCAM-1的表达，调节AS的发生和发展。

Wang等[16]敲除小鼠胚胎的miR-126，发现小鼠的血管内膜完整性丧失，部分胚胎致死，存活小鼠血管形成能力缺陷。进一步实验发现，miR-126主要通过抑制转录因子SPRED-1（sprouty-related EⅤH-1 domain containing-1，SPRED-1）和磷酸肌醇3激酶调控亚单位（phosphatidylinositol 3-kinase regulatory subunit beta，PIK3R2）的表达，促进血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子的表达，进而促进血管新生。而调节血管新生的功能无论对于AS还是肿瘤均有重要意义。

2.4 miR-21

miR-21是发现较早的miRNA之一，人类miR-21的基因是定位于染色体17q23.2 FRA 17B脆性区域上的多顺反子，具有自主转录单位。研究发现其是与糖尿病及不同类型肿瘤相关性较高的miRNA之一。

miR-21可以直接与Toll样受体结合，经由TLRs-NF-κB通路发挥作用。Fabbri等[17]实验发现，肺癌细胞外核体释放的miR-29a和miR-21可以通过结合并激活TLR7、TLR8，继而激活 IκK，诱使 IκB 发生磷酸化，介导 NF-κB 的活化，促进相关炎症因子的释放。

Fleissner等[18]证实，冠心病患者血浆中内源性NO合酶抑制剂非对称二甲基精氨酸（asymmetric dimethylarginine，ADMA）水平较高者，外周血内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPC）中miR-21的水平也相应提高。ADMA可通过miR-21介导，抑制EPC血管新生，引起血管内皮功能不全。同时，miR-21也可通过抑制SOD2和SPROUTY-2基因的表达在ADMA促EPC活性氧生成中起重要作用。以上研究提示，miR-21可能具有促进AS进程的作用。

Salas-Pérez等[19]实验测得 1 型糖尿病（type 1 diabetes，T1D）患者外周血单个核细胞中miR-21表达水平下调。T1D的病理特征是胰岛β细胞死亡。Ruan等[20]提出NF-κB-miR-21-PDCD4轴在T1Dβ细胞死亡过程中起重要的作用。NF-κB可调节下游miR-21的转录激活，而miR-21的下游调控靶点为肿瘤抑制基因程序性细胞死亡4基因（programmed cell death 4，PDCD4，其可通过上调Bax家族的凋亡蛋白来诱导细胞凋亡）。病理性 β细胞中，NF-κB家族的 p65和c-Rel激活了miR-21的基因启动子，miR-21的表达增加，高表达的miR-21使PDCD4水平下调，使β细胞功能衰竭。

3 针对miRNA诊断与治疗相关心血管疾病

最新研究证实，由人类器官组织产生的特异性miRNA，分子质量更小，具有很强的稳定性，更易进入血液循环系统，可在血浆中被检测到。而血浆样品较易获得，检测损伤小，这就为实现其作为疾病的检测、预后等的生物标志物提供了可能。

3.1 miRNA作为诊断与治疗手段的可能性

理想的生物标志物应该满足：以非侵入性方式获得；对于疾病或病原体具有高度的特异性；在临床症状的早期阶段即能可靠指示，随着疾病的转归呈现相应的改变；易于实现从实验室到临床实施的转化；经济，操作简单，样品易得。miRNA作为标志物的优势：（1）在各种体液中都很稳定；（2）大多数miRNA的序列在不同物种间是保守的，易于实现转化；（3）miRNA的表达通常是组织特异性的或者生物进展特异性的；（4）测定miRNA水平的技术手段日益完善，如RTPCR，Microarray等[21]。运用miRNA进行疾病的调控无非是促进或者抑制表达异常的miRNA。对于上调的miRNA，可以采用基因敲除的方法抑制或下调其表达水平，如antimiRNA寡核苷酸（anti-mirna antisense oligonucleotides，AMOs），miRNA海绵等；而对于表达受抑制的miRNA，可以采用基因敲入的方法，导入外源miRNA，增加其表达水平，以达到治疗的效果，如miRNA模拟物（miRNA mimics）[22]。

3.2 miRNA与心血管疾病的诊断与治疗

心血管疾病的生物标志物目前还倾向于特异的蛋白，如肌钙蛋白、B型尿钠肽等。而蛋白标志物在检测时存在成分复杂、不易分离等缺点，检测操作繁琐且易出现误差[23]。而检测样品中循环miRNA水平相对便捷，且miRNA参与多种心血管疾病的发生发展进程，将其作为靶标进行治疗正逐步得以实现。

Li等[24]研究显示，原发性高血压患者人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMⅤ）病毒滴度显著高于对照组（1 870：54），提示高血压可能与巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMⅤ）感染有关。比较健康者与原发性高血压患者miRNA谱，发现HCMⅤ-miR-UL112水平与HCMⅤ病毒滴度呈正相关（P=0.003），编码HCMⅤ的HCMⅤ-miR-UL112特异性升高，因此将其作为高血压特异度相关的miRNA。

TLRs与AS斑块的形成和稳定性有关，斑块脱落或破裂会引起血栓和栓塞，加重原有心血管疾病。Takahashi等[25]采集冠心病患者和健康受试者血浆发现，患者组较对照组外周血 miRNA-146a/b水平提高，TLR4、IRAK1和 TRAF6的mRNA增多及TLR4蛋白含量升高。在服用他汀类药物联合替米沙坦或依那普利治疗1年后，冠心病组的TLR4蛋白表达水平和miRNA-146a/b水平较服药前均显著下降。

AS和冠状动脉狭窄是导致心肌梗死的原因，对于急性心肌梗死中心肌特异性的miRNA会漏入循环中的假设，几个实验组分别进行了研究，证实在急性心肌梗死患者血浆中，缺血1 h内 miR-208a、miR-499、miR-1和 miR-133的含量均呈现持续升高的趋势，相比正在使用的检测手段可能更为灵敏[26]。

Cheng等[27]检测了大鼠缺血预适应后的miRNA变化，发现miR-21升高最显著，其作用于PDCD4，可减轻心肌缺血再灌注损伤。

3.3 miRNA与糖尿病的诊断与治疗

随着生活水平的提高，饮食偏重肥甘厚味加之生活方式的改变等使糖尿病（diabetes mellitus，DM）的发病率逐年升高，其并发症导致的死亡率也居高不下。及早诊断治疗糖尿病可减轻心血管并发症的发生，提高患者生活质量。许多miRNA有组织特异性，在病变状态下表达会产生较大差异，且miRNA的表达变化一般先于疾病发生[28]。因此，从miRNA角度对糖尿病进行诊断与治疗不可或缺。然而，目前还未明确与DM及其并发症相关的特异性miRNA，但miRNA仍可作为辅助检测与治疗手段。

有研究者采集健康者、DM患者和糖尿病肾病患者血清，每组5例，利用AB公司Taqman human miRNA arrayset v3.0A+B板低密度芯片进行检测后，用SYBR Green法对芯片结果进行实时RT-PCR验证，发现随着DM、糖尿病肾病病程的进展，miR-1179逐渐上调，miR-148b、miR-150逐渐下调[29]，这3个miRNA有可能参与DM及其并发症的发病机制，作为DM发生发展的生物标记物。

Rong等[30]测定汉族人群新近检测出患有2型糖尿病的患者及健康人群血浆中miR-146a的表达水平（被纳入的患者首次被检测出患有糖尿病，有任何其他临床体征，如急慢性炎症性疾病、急性呼吸道感染或恶性肿瘤的患者均不予入组）发现患者血浆中miR-146a的表达水平较健康人群明显增高，但miR-146a的临床应用价值仍需进一步探索。

由于与DM及其并发症特异相关的miRNA仍未得到确切认证，因此对miRNA介导的DM治疗也处于初步探索阶段。

4 小结与展望

各种心血管疾病具有病程长、病因复杂、健康损害和社会危害严重等特点，需要加强研究以便更好治疗。由于多种心血管疾病都涉及炎症反应，而部分miRNA与炎症及相关疾病都存在确凿的联系，从而产生了利用miRNA进行疾病诊疗的设想。尤其传统诊断方法因灵敏度或者操作繁琐而有待提高，这就为miRNA的应用奠定了基础。新近发现并得到继续研究的与炎症相关的miRNA还有很多，可是不得不指出，miRNA的实际应用也存在瓶颈，如一个miRNA的靶基因往往存在多个，如何将外源miRNA高效导入并进入特异位置发挥固定作用而不影响其他基因，仍未得到理想答案。炎症与各种心血管疾病的研究仍需深入，而miRNA与炎症相关疾病的关系需跟进。同时存在基础研究与临床研究脱节，临床实验设计不合理，样本数过少，横向研究间差异较大等问题也应在今后的研究中予以改善。