诱导性多潜能干细胞在心血管疾病中的应用

邹琪 张新超

作者单位：100730北京医院急诊科

心血管疾病已经成为人类最大的健康威胁，寻求有效的治疗措施尤为迫切。骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞等多潜能干细胞可分化为带有特定心肌细胞标记物的细胞，具有心肌自主收缩功能，改善心脏功能，内皮祖细胞可促进心脏血管新生，或许干细胞治疗能为治疗心血管疾病提供新的契机。但多潜能干细胞分化不确定性、同种异体移植引起的移植排异反应和胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESC）伦理问题阻碍了它的发展[1]。然而2006年发现的诱导性多潜能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPS）为干细胞治疗带来了新的希望。iPS细胞是Takahashi和Yamanaka用反转录病毒向鼠成纤维细胞中导入 Oct3/4、Sox2、Klf4和 c-Myc（OSKC）4种关键基因的转录因子获得的一种类干细胞，可分化为内、中、外3个胚层，具有生殖系传递和四倍体互补的干细胞特点[2]。将其与ESC进行比较发现，两者在形态学、增殖能力、表面抗原、基因表达、表观遗传学和端粒酶活性等方面均非常相似[3-4]。由于此项技术操作简单，不需要使用卵细胞或胚胎细胞，所以避开了胚胎干细胞研究应用带来的伦理道德问题和同种异体移植的排异问题[5]。本文就iPS细胞在心血管疾病中的研究应用进展作一综述。

1 iPS细胞的产生方法

1.1 反转录法

iPS细胞的来源十分丰富，目前已经分别从人B淋巴细胞、胰腺细胞、肝细胞、胃壁细胞、神经细胞、睾丸细胞、骨髓细胞成功获得[6-9]。相比较而言，存储量大、易获得、损伤小的皮肤细胞、CD34+细胞、角质细胞、脂肪细胞和尿液中尿路上皮细胞[10]更受到研究人员的青睐。iPS细胞除了用逆转录病毒制备外，腺病毒[11]、慢病毒[12]、仙台病毒[13]、转座子和质粒表达载体[14]均能将转录因子插入体细胞，其中反转录病毒、慢病毒表达基因相对稳定，但安全性差；仙台病毒安全性相对较高；腺病毒可不整合至宿主基因，致癌风险降低，但诱导效率极低且表达不稳定；转座子和质粒表达载体的长期安全性尚不明确。

从iPS细胞的安全性考虑，c-Myc作为致癌基因，重新激活可能导致肿瘤，而且过量表达癌相关基因会引起细胞凋亡和衰老[15]，研究人员尝试使用无 c-Myc的转录体系OSK[16]，或用L-Myc替代c-Myc[17]诱导iPS细胞。近期研究者们还通过生物信息学分析，设计出了一组新的转录因子组合，包括 Sall4、Nanog、Esrrb 和 Lin28，称为 SNEL，它们没有依赖在体细胞基因组中比较活跃的部分：Oct4和Sox2，故能够诱导产生高质量的iPS细胞[18]。Shu等[19]的研究发现，如果同时过表达中内胚层和外胚层分化因子就可同时替代Oct4和Sox2，而细胞仍具有多潜能性，这一观点打破了过去认为将体细胞转变为多潜能干细胞，需要用在多潜能细胞中高表达的转录因子诱导，并且维持干细胞多潜能性的干性因子和调节发育与分化的因子是相互抑制的观点，提示转录因子之间的相互作用可能在形成高质量的iPS细胞的过程中扮演着重要的角色。还有研究发现，自噬过程对iPS细胞的产生十分重要，Sox2能够在重编程的早期下调mTOR的表达启动自噬。自噬作用在诱导第一天出现，第二天达到高峰，如果抑制Sox2会导致自噬作用不能启动，进而无法获得iPS细胞。

1.2 小分子复合物法

小分子复合物协同一个或多个转录因子也可诱导iPS细胞产生[20]，其中CYT296可通过染色质解聚使OSKM诱导iPS细胞的效率增加10倍，并可与Oct4一起诱导细胞重编程[21]。Hou等[22]完全脱离转录因子，仅使用7个小分子组成ⅤC6TFZ（DZNep）化合物替代OSKM诱导鼠胚胎成纤维细胞获得iPS细胞，称为化学诱导的多潜能干细胞，其中C6FZ起决定作用。由于无转录因子参与，这可能是比较安全的诱导方法。

1.3 微小RNA法

微小RNA（miRNA）也可与转录因子共同诱导体细胞重编程。Miyoshi等[23]报道了一套miRNA靶基因，包括P21、RBL2、MeCP2、TGFbR2、RHOC 等，耗竭这些基因可促进 iPS细胞形成，目前已经成功将鼠和人成纤维细胞、脂肪细胞重编程为iPS细胞。这种方法效率是OSKC方法的100倍以上，其原因可能是miRNA302抑制NR2F2，直接上调Oct4表达[24]。

2 iPS细胞在心血管疾病中的应用

心血管疾病是危害人类健康的一大凶手，由于心肌细胞的再生能力较差，一旦出现坏死形成瘢痕组织，心脏功能便逐渐不可逆减退，最终发展为心功能衰竭，缩短生存期、影响患者生活质量。iPS细胞的出现有望为心血管疾病的治疗打开新局面、为致病机制研究提供新方法。

2.1 细胞治疗

有多项实验研究表明，人和鼠iPS细胞或iPS分化的心脏祖细胞可在体内分化为心血管细胞系，形成新生血管，并通过旁分泌作用促进心脏再生[25]，缩小梗死范围，减轻急性心肌梗死导致的左室功能不全和心肌重构[26-27]。并有研究显示，iPS细胞激活Notch通路，使Notch-1，Hes-1和pAkt表达上调，PTEN水平下降，减少血管和间质纤维化[28]。Malecki等[29]使用生物工程的一种抗体作为桥梁，识别iPS细胞和心肌细胞表面的受体，将iPS细胞富集到梗死部位进行心肌发育。近两年iPS细胞技术已从实验室走向临床研究，有3项I期临床试验已经得出鼓舞人心的结论。SCIPIO试验（缺血性心肌病患者干细胞注射）是I期随机公开试验。试验选取心肌梗死后左室功能障碍（LⅤEF＜40%）患者，冠状动脉注射自体心耳细胞诱导的c-Kit阳性心脏祖细胞17例为试验组，7例为对照组。发现试验组LⅤEF明显提高，治疗1年和4年时LⅤEF分别提高8%和12%，梗死面积显著降低，生活质量明显提高[30]；而CADUCEUS试验也发现，治疗组整体心脏功能虽无明显改善，但活力心脏面积有所增加（6个月时减少7.7%，12个月时减少12.3%），局部心肌收缩功能好转[31]。Naofumi的ALCADIA试验纳入6例缺血性心肌病患者，取自体心内膜心肌细胞诱导为干细胞，在CABG术中将自体心肌干细胞注入梗死部位（细胞数50万个/kg），再覆盖含纤维生长因子的可降解明胶细胞膜片，观察6个月后患者的左室射血功能、梗死面积和临床症状，随访1年的主要心脏事件。其中1例在术后3周发生急性梗死事件，1例在随后1年的随访中心脏功能恶化，没有其他严重不良事件发生。6个月后患者LⅤEF均有改善，超声评估提高9%，MRI评估则提高了12%，梗死面积减少3.3%，而最大有氧运动能力增加 4.5 ml·kg-1·min-1[32]。几个初步试验的结果，无疑在给缺血性心脏病的治疗方法上提供了新的思路与空间，寄希望能彻底挽救心脏功能，提高患者生存率和生存质量。

2.2 生物膜片和脱细胞骨架移植

随着细胞重编程技术和组织工程的结合，细胞膜片和脱细胞骨架为iPS细胞移植提供了新的途径[33]。Shimizu等[34]研究表明，细胞膜片移植的成功率要高于细胞注射，植入后膜片上存活的细胞还可持续分泌细胞因子促进血管新生化、减少纤维形成和募集干细胞至损伤部位，改善受损心脏的功能。增加移植部位的血运可提高移植成功率。Kawamura等[35]使用iPS-CMs制成的心肌细胞膜片与带蒂网膜一起植入猪的心脏，2个月后移植部位血管密度明显增加，血运丰富的位置有大量表达心脏肌钙蛋白T的细胞。Sawa等[36]将其应用于临床，他们使用自体成肌细胞膜片经胸腔镜植入扩张型心肌病患者的左心室外侧，使患者心脏功能明显提高。将细胞膜片重叠堆积，每层膜片形态和电传导系统相互连接后可形成3D心脏组织，具有心脏组织样搏动，并能维持心脏形态学特征[37]。

多潜能细胞分化来的心肌细胞种植于脱细胞心脏骨架后可形成排列有序的心肌组织，产生同步收缩[38]。Lu等[39]使用人皮肤源iPS细胞分化出心脏祖细胞，将其附着在鼠心脏脱细胞骨架上，细胞可附着其上成长并发展成心脏肌肉，历经20 d血液供应后，此重建鼠器官再度以40～50次/min的频率开始收缩。Bearzi等[40]通过生物工程方法获得可分泌胎盘生长因子（PIGF）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）的iPS细胞，将其用水凝胶密封在聚乙二醇纤维蛋白原骨架上，植入心肌梗死模型小鼠的心肌，发现PIGF和MMP-9能促进血管再生，改善血流动力学参数。以上研究结果提示，iPS细胞不但可为同源器官提供新的来源，还可能用于心肌梗死、心力衰竭的治疗，改善、抑制心力衰竭时发生心律失常。

2.3 建立疾病模型

目前，研究疾病致病机制和可能的治疗方法通常是通过建立基因缺陷的动物模型，但是将研究成果从动物模型转移到人还存在许多不确定性。iPS技术可取患者自身的体细胞重编程而成为患者自身特异性的iPS细胞系（PsiPS），从而就建立了人的疾病细胞模型，在细胞水平、基因水平和表观遗传学水平对其进行研究。一些不易制备动物模型的罕见病症，也可通过此方法来建模[41]。目前已经建立PsiPS的疾病有长QT综合征、Timothy综合征、儿茶酚胺敏感的多形性室速[12]、致心律失常右室心肌病[42]、左室发育不良[43]等，通过这些模型不但可研究遗传性疾病的致病原因，还可用于药物安全性、毒性测试。Drawnel等[44]已经成功用2型糖尿病患者iPS细胞建立糖尿病心肌病药物筛选模型，在体外筛选高糖环境下对心肌有保护作用的药物。将此技术结合组织工程或可使疾病模型商业化，如Wang等[45]用Barth综合征粒细胞心肌病患者的体细胞诱导产生iPS细胞，通过组织工程改造制成具有疾病形态学特点的“心脏芯片”，通过基因替代和基因编程找到其致病原因为TAZ突变。另外，这项技术也可应用于非遗传性疾病，如在病毒性心肌炎的研究中，Sharma等[46]用表达荧光的柯萨奇病毒B3病毒株感染人iPS细胞，使其表达柯萨奇病毒和腺病毒受体，用于研究抗病毒药物的疗效和预测柯萨奇病毒易感人群。

3 小结与展望

iPS技术在生命科学领域具有里程碑意义，它为再生医学、干细胞治疗注入新的希望，使医学发展迈入一个新的台阶。但是多潜能干细胞的成瘤性仍然是限制其使用的主要原因，Ahmed等[47]发现分化程度低的iPS细胞易在移植后导致肿瘤发生，其原因可能是由于Oct4[48]和Nanog[49]的表达，目前发现使用二甲双胍可抑制iPS细胞的成瘤性而不影响其多潜能分化。如果能保证它的安全性、高效性和特异性，将使目前临床医学产生革命性的变化，开辟疾病诊治、药物研究、器官移植的新途径。