桃红颈天牛肠道纤维素降解菌的筛选及其对肉仔鸡生产性能的影响

2015-01-21苏丽娟高新浩王石垒宋安东王文博

饲料工业 2015年7期

■苏丽娟高新浩王石垒宋安东王文博

(1.河南农业大学生命科学学院动物基因工程实验室和能源微生物实验室，河南郑州 450002；2.青岛根源生物集团，山东青岛 266061)

木质纤维素类生物质是自然界中存在量最大的一类清洁可再生资源，但它是由木质素、纤维素和半纤维素组成的复杂立体网状聚合体，这种特殊结构使植物体具有抗生物降解的各种特性。白蚁、木食性甲虫、切叶蚁等昆虫能够将木质纤维素类生物质作为唯一的食物来源，并具有降解和转化木质纤维素的能力，是自然界中协助碳循环的重要节肢动物[1]。纤维素酶的重要来源之一是动物，研究人员在越来越多的节肢动物和软体动物体内发现了内源性的纤维素酶。其中，天牛属鞘翅目，幼虫生活于木材中，蛀食植物的木质部，具有很强的消化木质纤维素能力。近年来有多位研究者从天牛肠道内筛选到可降解纤维素的微生物或者分离纯化到具有木质纤维素酶活性的蛋白质，如Sugimura等(2003)、Wei等(2006)分别从黄星天牛Psacothea hilaris、桑天牛Apriona germari幼虫肠道中纯化出β-1,4-葡聚糖酶[2-3]，刘晨娟等(2010)从桑肩粒天牛肠道内筛选到一株可降解纤维素的枯草芽孢杆菌[4]。因此，天牛可作为木质纤维素降解菌的菌源进一步研究。

芽孢杆菌能改善动物的生长性能并有益于动物健康，但其作用机理目前还知之甚少，主要包括三方面的假设：①改善肠道功能[5]；②具有抗菌活性[6]；③刺激固有或/和体液免疫系统[7]。由于枯草芽孢杆菌具备强的抗逆性结构——芽孢，可以保证其在与饲料混合制粒、接触饲料药物和矿物元素等物质时产生较低损失，进而保证其在使用过程中的活力[8]。另外枯草芽孢杆菌还可以产生蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶等消化酶和拮抗病原微生物，这些功能可以增强肠道微生态系统逐步成熟、黏膜免疫以及系统免疫发育不健全雏鸡的肠道微生态发育。芽孢杆菌是广泛分布于自然界的需氧性细菌，在机体肠道内通过生物夺氧作用促进厌氧有益微生物的生长，并且芽孢杆菌在生长繁殖的过程中能产生抑制某些有害微生物的代谢产物，有助于恢复肠道微生态平衡，因而其研究和应用价值受到广泛重视。

本试验用纤维素-刚果红培养基从桃红颈天牛幼虫肠道内微生物筛选到了一株高纤维素酶活性枯草芽孢杆菌，并对其饲料制粒的抗逆性进行了探讨和其饲料制剂在肉仔鸡生产中饲料潜能进行了研究，可经过后续的工业化扩大培养或诱变育种后改善其应用性能，为饲料生产提供有效的抗生素替代物，也为生物质资源的转化利用提供高效的微生物菌种。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基

富集培养基：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)5.00 g/l、NH4H2PO40.50 g/l、K2HPO42.00 g/l、MgSO42.00 g/l、MnSO4·H2O 0.002 5 g/l、FeSO4·7H2O 0.007 5 g/l、NaCl 0.30 g/l、pH值6.8。初筛培养基：CMC-Na 1.88 g/l、K2HPO40.50 g/l、MgSO40.25 g/l、琼脂 20.00 g/l、刚果红0.2 g/l、pH值7.4。复筛培养基：CMC-Na 5.00 g、牛肉膏5.00 g、蛋白胨1.00 g、秸秆粉5.00 g、NaCl 5.00 g、pH值7.4。

1.1.2 试验动物

桃红颈天牛(采集于郑州市果树研究所的桃树)；不同龄的白羽肉鸡。

1.2 菌株筛选

1.2.1 初筛

在超净工作台中解剖天牛幼虫，无菌分离出天牛肠道内容物制成菌悬液，4℃静置3 h。吸取50 μl肠道菌悬液上清，加至装有3 ml富集培养基的试管中，37℃200 r/min摇床培养10 h。将富集培养液适当稀释，涂布于初筛平板，37℃倒置培养2～3 d。挑取长势较好、水解圈明显的菌落用三区画线法和涂平板法交替分离单菌落。将分离到的单菌落接种到斜面种子培养基中4℃保藏。

1.2.2 初筛培养基的优化

选择最佳的CMC-Na用量、pH值和最适培养时间，按照表1所示三因素水平优化初筛培养基，用接种针蘸取少量稀释菌液在培养基的上下左右4个区域各自点4个点，37℃倒置培养5 d，每0.5 d检测一次水解圈直径，并用A=d/t[d：透明圈直径(cm)；t：培养时间(d)]计算相对酶活。

表1 CMC-Na用量、pH值和培养时间3因素水平

1.2.3 揺瓶复筛

将选取的相对酶活较高的菌株进行10 h富集培养，再按1%的接种量摇瓶复筛，37℃，160 r/min震荡培养，每24 h取1次样测定酶活，连续测定5 d。

1.3 酶活测定

1.3.1 FPA酶活测定

将滤纸放入硅胶干燥器中平衡24 h后制成宽1 cm、质量(50±0.5)mg的滤纸条，折成M形竖直放入试管底部。加入1.8 ml pH值4.8的0.1 mol/l的乙酸-乙酸钠缓冲溶液。取菌株发酵液4 000 r/min离心10 min，上清即为原酶液。加入0.2 ml适当稀释的原酶液，使试管内溶液浸没滤纸、盖塞、摇匀，50℃水浴60 min，加入2.0 ml DNS试剂摇匀。煮沸10 min灭活、显色，取出后迅速冷却至室温，加蒸馏水至15 ml，550 nm波长测量OD值。

1.3.2 CMC酶活测定

操作过程同滤纸酶活，不同之处是将滤纸改为1.8 ml 1%的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液，50℃水浴30 min。酶活定义：在上述条件下，每分钟产生1 μmol葡萄糖所需的酶量为一个酶活单位(U/ml)。根据试验测得的OD值，利用葡萄糖标准曲线，求出A(还原糖量，mg)，再利用酶活公式X=A×5×n×1 000/(180×t)求出酶活(X：羧甲基纤维素酶酶活力；n：试样的稀释倍数；t：反应时间，min)。

1.4 菌落16S rDNA PCR与测序

上下游引物P1，P2(P1，5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG AAC GCT-3’；P2，5’-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT TCA CCC C-3’)各1 μl、含有目的菌的纯水3 μl，加纯水至50 μl。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。琼脂糖凝胶，凝胶成像系统照相，割胶回收，PCR产物送交上海生工测序。

1.5 菌株发酵罐扩大培养

将筛选到的BSAB1306菌株先接种至3.0 ml的LB试管中，37 ℃、200 r/min的摇床培养8～12 h，再按1∶100的比例接种至50 ml的LB培养基的锥形瓶中，37℃、200 r/min培养12 h后转接至5 L优化培养基的发酵罐中进行发酵培养，37℃、800 r/min、pH值7.0、通气量10 L/min的稳定条件下进行发酵培养，并间隔一定时间提取适量发酵液，离心取上清液测定酶活力。

1.6 菌株对饲料制粒的耐受性及pH值2.0胃蛋白酶对菌株存活的影响

在白羽肉鸡核心饲料中加入所筛选菌株，通过搅拌、调质和制粒后，取10组样品，每组不少于35个样，每个样品不少于5 g[9]。样品分别在不同温度下密封放置1、10、20、30、40、50 d，检测其中菌株的含量变化，并将样品中菌株含量与配方中菌株含量对比，每个样品做3个重复，取平均值。取200万CFU/g的菌株，置入pH值2.0胃蛋白酶浓度0.32%的溶液中，39℃处理不同时间，检测其中菌的含量变化，每个样品做3个重复，取平均值。

1.7 试验设计

选择体重相近的20只30日龄白羽肉鸡，先预饲无BSAB1306菌株饲料72 h，空腹2 h，然后饲喂含BSAB1306菌株饲料（200万CFU/g），在禁食（自由饮水）1.5 h后进行屠宰。

1.8 BSAB1306菌株的肠道萌发率试验及其在鸡粪便中芽孢的变化

取白羽肉鸡的十二指肠、小肠、大肠食糜，分别分为两份，一份直接平板计数，另一份100℃水浴处理20 min后平板计数，每个样品做3个重复，取平均值。萌发率=[1-(高温处理后菌株含量/未处理时菌株含量)]×100%。饲喂后不同时间分别收集鸡粪样品，经匀浆后，75℃热处理20 min，生理盐水稀释，LB培养基平板涂布，37℃培养36 h后进行菌落计数。鸡粪样品芽孢含量(CFU/g)=菌落数×稀释倍数×10×1 000/6。

1.9 复合芽孢杆菌制剂对肉鸡肠道中微生物区系及生产性能的影响

试验于2013年6月在山东省潍坊地区邵家鸡场进行，共有8栋鸡舍的白羽肉鸡参与试验，每栋鸡舍约20 000只鸡，遵循正常的用药程序和免疫程序，8栋鸡舍随机分为对照组和试验组，试验组在用药2 h后添加复合芽孢杆菌制剂。试验周期从第2周龄、第3周龄和第5周龄选择，每周龄第7 d采样分析。每次采样每栋鸡舍随机取4只活鸡带回实验室，屠宰后取盲肠食糜，分析盲肠食糜中大肠杆菌菌落数目、微生物菌体蛋白和氨态氮水平；同时记录每栋鸡舍的生产性能，包括死淘率、胴体重和料肉比。

1.10 数据处理

试验数据经Microsoft Excel初步处理后,结果以平均值±标准差表示，数据处理与分析采用SPSS 16.0统计软件进行方差分析，并采用LSD法进行多重比较，以P＜0.05为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 单菌落分离及初筛及纤维素酶活

通过多次反复在初筛培养基上涂平板、划线，挑选出十一株水解圈明显、长势较好的菌落进行种子保存。通过连续5 d培养得到不同配比的培养基的相对酶活，用SPSS提供的一般线性模型的“Univariate”过程，对其进行方差分析。各因素对试验结果的重要顺序依次为时间＞CMC-Na＞pH值，综合各种因素，确定其最适CMC-Na用量为1.88 g/l，pH值为7.4，培养时间为1 d。筛选到长势较好的11株菌的CMC酶活性和FPA酶活性见表2，其中4、6号的CMC和FPA酶活最高。

表2 11株菌株CMC酶活、FPA酶活(U/ml)

2.2 菌落形态和16S rDNA PCR

其中酶活较高的4、6号菌株的菌落形态、颜色及革兰氏染色等理化性质如表3所示。并对其16S rDNA进行菌落PCR扩增，琼脂糖电泳图见图1，PCR产物送上海生工测序，测序的结果通过NCBI-BLAST的序列进行比对，发现彼此相似度为99%，且与Gen Bank数据库中的枯草芽孢杆菌的基因序列相似度达到99%。故确定它们为枯草芽孢杆菌，将6号命名为BSAB1306。

表3 4号和6号菌株理化性质

图1 PCR产物电泳结果

2.3 BSAB1306菌株发酵罐扩大培养后的酶活

对BSAB1306菌株上发酵罐扩大培养后的酶活进行测定，发现其CMC酶活性由培养前的68.27 U/ml提高到163.86 U/ml，相关的木聚糖酶、β-葡聚糖酶、中性蛋白酶和α-淀粉酶活性分别是9.20、21.10、216和723 U/ml。

2.4 BSAB1306菌株对饲料制粒的耐受性以及菌株在肠道萌发率试验

BSAB1306菌株耐受饲料制粒试验表明该菌种通过饲料制粒后，在不同的温度、不同时间保存后菌株的菌量损失较小，不会影响到配方成分的效果发挥(见表4)。该菌株在十二指肠萌发率为94.6%，在小肠萌发率为80.4%，在大肠的萌发率为45.1%，能达到定点萌发，可在相应位置发挥相应的作用，且芽孢菌营养体在大肠又开始形成芽孢。

表4 BSAB1306菌株在不同温度、时间下的成活率(%)

2.5 pH值2.0胃蛋白酶对BSAB1306菌株存活率及肉鸡粪便中菌株芽孢变化的影响

对BSAB1306菌株用pH值2.0值、胃蛋白酶0.32%的处理不同时间后产品中菌量和0 min(对照)差异并不显著，说明BSAB1306菌株能以较高存活率通过动物的胃部，能够耐受一般胃液的消化(见表5)。从图2可以看出，试验组白羽肉鸡饲喂芽孢杆菌3 h后，鸡粪中开始检测到饲喂芽孢的存在，24 h肠道中的芽孢排出达到最高峰，以后粪便中的芽孢数成下降趋势，直至120 h后，肠道中的芽孢基本全部排出，证明芽孢杆菌在肉鸡的肠道中有所滞留。排出的BSAB1306菌株芽孢的总数为(30.63±2.72)×108CFU/g，排出的芽孢总数为饲喂芽孢总数的3.06倍，表明该菌株在肉鸡的肠道内萌发繁殖后又形成了芽孢，并最终排出体外。

表5 pH值2.0胃蛋白酶对BSAB1306菌株存活的影响（×109个/ml）

图2 不同取样时间试验组鸡粪样品中芽孢的数量

2.6 BSAB1306菌株复合制剂对肉鸡肠道中微生物区系及生产性能的影响

在遵循正常用药程序的白羽肉鸡日粮中添加BSAB1306菌株复合制剂后，肠道中大肠杆菌及生产性能的表现见表6，其中第2、第3和第5周龄试验组鸡肠道食糜中大肠杆菌的数量显著低于对照组(P＜0.05)，表明日粮中添加BSAB1306菌株复合制剂显著降低了白羽肉鸡盲肠食糜中大肠杆菌的数量。肠道食糜微生物菌体蛋白含量从侧面反映出肠道微生物的总数，第2和第3周龄试验组肠道食糜中微生物菌体蛋白含量显著高于对照组(P＜0.05)，表明BSAB1306菌株复合制剂显著降低了第2周龄盲肠食糜中微生物的数量，分析认为BSAB1306菌株复合制剂可能促进了除大肠杆菌外其它微生物的生长，从而有益于动物健康。而饲料中添加BSAB1306菌株复合制剂后白羽肉鸡的死淘率和料肉比有所减少、酮体重有所增加，但差异不显著，表明其能够通过降低肠道大肠杆菌数量改善肠道微环境，提高鸡的生产性能。

表6 BSAB1306菌株复合制剂对不同周龄肉鸡肠道中微生物区系及生产性能的影响

3 讨论

3.1 一株高纤维素酶活菌株的筛选

目前已经有多位研究者报道了天牛肠道内的高纤维酶活性，如星天牛Anoplophora chinensis和松墨天牛Monochamus alternatus Hope等[10-11]。天牛和食木白蚁均以木材为食，木材中纤维素含量较高，而维生素、蛋白质等营养成份含量较低。研究表明，天牛对粗纤维的消化率为12%～57%，白蚁对粗纤维的消化率为65%～99%。而桑粒肩天牛和高等白蚁肠道微生态结构较为相似[12]。也有从天牛肠道内分离到可降解纤维素微生物的报道，表明天牛肠道内木质纤维素的降解依赖与天牛内源性木质纤维素酶和肠道共生微生物的共同作用，因此天牛肠道微生物也是寻找降解木质纤维素酶的一个重要来源。

3.2 BSAB1306菌株的饲料制剂的耐受性探讨

本试验从桃红颈天牛幼虫肠道中筛选到一株CMC酶活较高的枯草芽孢杆菌，经过发酵培养纤维素酶活性远高于同类昆虫来源的微生物[13]，又由于枯草芽孢杆菌可自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用，同时其芽胞是一种致密的蛋白结构，将菌体的完整包裹在其中，可克服饲料制粒时存在高温、高湿、高压及物理剪切等不利于普通微生物的生长因素，而BSAB1306菌株饲料制粒后在50℃下保存50 d菌株存活率仍能达到94.58%，表现出很强的耐热、耐物理剪切力的能力。动物的消化道多为酸性环境，尤其胃内pH值更低，大多数微生物不能在酸性环境中存活，而BSAB1306菌株以芽孢的形式存在能够耐受一般浓度的胃液消化，pH值、胃蛋白酶对菌株存活率影响不大。不萌发的枯草芽孢菌处于休眠状态，只有在十二指肠、小肠中脱去芽孢时候才能发挥应有的作用，该菌株在十二指肠的萌发率为94.6%，萌发后的芽孢杆菌以营养体的形式存在，有较强的产酶、产酸、抑菌能力，故该菌株具有极高的制作饲料的潜能。

3.3 BSAB1306菌株复合制剂对肉鸡肠道中微生物区系及生产性能的影响

本试验分析了BSAB1306菌株复合制剂对白羽肉鸡肠道微生物区系的影响，结果表明BSAB1306菌株复合制剂可改善了肠道微生物区系和微生物菌体蛋白含量。Vila等(2009)证明给肉仔鸡饲喂东洋芽孢杆菌可抑制肠炎沙门氏菌的生长，表明枯草芽孢杆菌制剂可以改善白羽肉鸡的肠道微生物环境[14]。本试验考察了BSAB1306菌株复合制剂对白羽肉鸡生产性能的影响，结果没有达到显著性影响（P＞0.05）。有研究表明在日粮中添加芽孢能提高饲料转化率[15]。然而，芽孢杆菌对动物生长性能影响的结果并不一致，Edens(2003)报道在日粮中添加以枯草芽孢杆菌为主的益生菌虽然改善了42日龄肉鸡的饲料转化率，但对体增重没有影响[16]。而Vila(2009)等研究发现东洋芽孢杆菌的添加同时改善了42日龄肉鸡的饲料转化率和体增重[14]。芽孢杆菌对肉鸡肠道微生物区系的作用效果和肉鸡生产性能的影响不一致可能与添加的不同种芽孢杆菌菌株有关，也许与芽孢杆菌添加的方式和剂量等有关。另外，本试验中抗生素在日粮中的使用可能也影响了复合芽孢杆菌效果的发挥。因此本试验中筛选的枯草芽胞杆菌具有较高的纤维素酶活性，也具有很好的饲料应用潜力，其复合制剂可以通过产生纤维素酶、蛋白酶等消化酶类有助于食物的消化；通过抑制大肠杆菌和提高总微生物含量改善肠道微生物群落结构，改善肉仔鸡的生产性能，可以作为益生菌添加到饲料中，改善畜禽的肠道生态结构，替代抗生素的应用。