壳聚糖对饲料镉胁迫下吉富罗非鱼生长、肠道消化酶活性、血清生化指标及镉残留的影响

2015-01-21翟少伟贾景涛孙秀文

饲料工业 2015年20期

■翟少伟贾景涛孙秀文

（集美大学水产学院，福建厦门 361021）

近年来，重金属污染日趋严重，镉是水产品安全监测项目中必测项目之一。其化合物毒性大，易通过水环境及进食累积在水产动物体内，影响水产动物生长及产品的安全。目前，水环境镉对水产动物毒性的报道较多，而饲料镉对水产动物毒性的研究甚少。饲料镉作为水产养殖生产中重金属威胁的重要来源之一，应该引起足够的重视，必须警惕其危害[1]，采取有效措施减缓其对动物的毒害影响。使用安全高效驱除饲料重金属的添加剂成为人们的研究重点，如蒙脱石、沸石粉、石墨、曲渣、二氧化硅等非金属矿物质对重金属有不同程度吸附，以减少动物对重金属的吸收[2]。这些物质一般在饲料中的添加量大、无特异性吸附，且易对水体造成二次污染。

目前，壳聚糖（Chitosan，CTS）在污水处理方面有良好效果，对过渡金属元素有特异性吸附，其具有来源广、安全、无毒、耐碱、耐腐蚀、对环境友好等特点[3-5]。研究表明，低分子量CTS可通过吸附作用，与养殖水体中的镉结合，从而缓解镉致长江华溪蟹鳃细胞的毒害作用[6]；并且CTS可能在很大程度上通过发挥吸附作用减轻饲料镉对吉富罗非鱼（Genetic improvement of farmed tilapia，GIFT，Oreochromis niloticus）的急性毒性[7]。而在慢性毒性情况下，壳聚糖还能否减轻饲料镉对吉富罗非鱼的毒害作用，值得研究。因此，本试验通过研究饲料镉胁迫下，添加壳聚糖对吉富罗非鱼生长性能、肠道消化酶活性、血清生化指标及镉残留水平等方面的影响，评价CTS减轻饲料镉对吉富罗非鱼毒性的效果，为研发缓解饲料重金属对鱼类毒性的饲料添加剂提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验动物及试验设计

试验动物为吉富罗非鱼幼鱼，购于厦门诚毅水产公司，暂养2周后在集美大学水产学院生态实验室循环水系统进行饲养试验。从暂养鱼中挑选健康、规格一致、平均体重为（10.69±0.55）g的240尾吉富罗非鱼幼鱼，分为4个处理组，即：Cd组、Cd+0.5%CTS组、Cd+1.0%CTS组、Cd+1.5%CTS组，每个处理4个重复，每个重复15尾鱼，试验期为7周。

1.2 试验饲料

罗非鱼基础饲料参照“罗非鱼配合饲料”标准[8]配制，基础饲料的配方及营养水平见表1。基础饲料中镉本底值为0.21 mg/kg（绝干重）。根据贾景涛等[9]饲料镉对罗非鱼产生亚慢性毒性的研究结果，向基础饲料中添加氯化镉，各处理组饲料镉元素的水平均为50 mg/kg（实测值为55.12 mg/kg）。再分别添加0%、0.5%、1.0%和1.5%的CTS制成试验饲料。各种饲料原料粉碎后过40目筛后混合均匀，加水挤压成直径2.5 mm的颗粒料，保存于冰箱中备用。CTS为食品级，购于山东奥康生物科技有限公司，分子量约为3×105，脱乙酰度≥90%。

表1 基础饲料配方及营养水平

1.3 饲养管理

试验吉富罗非鱼饲养于循环水系统的水族箱内（70 cm×40 cm×40 cm），养殖用水体积约为90 L，水源为充分曝气除氯后自来水，日换水量为30%，空气压缩机24 h增氧；试验期间水温(28±2)℃，pH值为(7.5±0.3)，溶氧浓度7.5～7.8 mg/l，氨氮浓度＜0.2 mg/l。每日饱食投喂三次（8:00、13:00和18:00），投喂30 min后吸取残饵和粪便。饲养试验结束后，关闭循环水系统，继续进行3周静水试验。

1.4 样品采集

饲养试验结束后，禁食24 h，捞取每个水族箱中所有试验鱼称总重，随机选择6尾规格一致的试验鱼，按照卢俊姣等（2014）的方法采血，制备血清；取肌肉和肠道样品，并制备组织匀浆上清液。静水试验过程中，收集每个处理组吉富罗非鱼粪便及养殖水体样品。

1.5 测定指标及方法

1.5.1 生长指标

生长指标计算公式如下：

增重率（WGR，%）=100×（Wt-W0）/W0；

特定生长率（SGR，%/d）=100×(lnWt-lnW0)/t；

饲料系数（FCR）=FC/(Wt-W0)；

成活率(SR,%)=100×Nf/Ni。

式中：W0——每尾鱼平均初始体重（g）；

Wt——每尾鱼平均终末体重（g）；

FC——平均每尾鱼摄食饲料总量(风干样重，g)；

t——饲喂天数（d）；

Ni——初始鱼尾数；

Nf——终末鱼尾数。

1.5.2 肠道消化酶

脂肪酶和淀粉酶活性采用南京建成生物工程技术研究所提供的试剂盒进行测定。蛋白酶活性的测定采用福林-酚试剂法，以磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液调节pH值，680 nm处测吸光值。

1.5.3 血清生化指标

采用南京建成生物工程技术研究所提供的试剂盒及方法，测定血液中白蛋白（Albnmin，ALB）、尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）、谷丙转氨酶（Glutamicpyruvic transaminase，GPT）和谷草转氨酶（Glutamicoxalacetic transaminease，GOT）等生化指标。

1.5.4 镉水平

吉富罗非鱼饲料中镉水平和粪便中镉水平测定参照“饲料中镉的测定方法”[10]；组织中镉的测定参照“国家标准海洋监测规范第6部分：生物体分析”[11]进行。养殖水体不需前处理，离心后可直接通过火焰原子吸收光谱法测定镉水平。

1.6 统计分析

所有试验数据均以“平均值±标准差(Mean±S.D.)”表示，用SPSS 17.0分析软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，若存在显著差异，则采用Duncan's法进行多重比较，P＜0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 壳聚糖对饲料镉胁迫下吉富罗非鱼生长性能的影响（见表2）

由表2可见，Cd+CTS各处理组的WGR和SGR显著高于Cd组（P＜0.05），且随着CTS添加水平的增加逐渐升高；而FCR和SR各处理组间的差异不显著（P＞0.05）。Cd+CTS各处理组间WGR差异不显著（P＞0.05）；Cd+1.5%CTS组的 SGR 显著高于Cd+0.5%CTS组（P＜0.05），Cd+1.0%CTS组与 Cd+0.5%CTS组、Cd+1.5%CTS组间的差异不显著（P＞0.05）。

表2 CTS对饲料镉胁迫条件下吉富罗非鱼生长性能的影响

2.2 壳聚糖对饲料镉胁迫下吉富罗非鱼肠道消化酶活性的影响(见表3)

表3 CTS对饲料镉胁迫条件下吉富罗非鱼肠道消化酶活性的影响(U/mg prot.)

由表3可以看出，肠道消化酶的活性数值上随着CTS添加水平的增加而升高，仅Cd+1.5%CTS组淀粉酶活性显著高于Cd组(P＜0.05)，其他各处理组间无显著差异(P＞0.05)；Cd+1.0%CTS组和Cd+1.5%CTS组的脂肪酶活性显著高于Cd组(P＜0.05)，各Cd+CTS组间无显著差异(P＞0.05)；Cd+CTS处理组的蛋白酶活性显著高于Cd组(P＜0.05)，但三个Cd+CTS处理组间无显著差异(P＞0.05)。

2.3 壳聚糖对饲料镉胁迫下吉富罗非鱼血清生化指标的影响(见表4)

表4 CTS对饲料镉胁迫下吉富罗非鱼血清生化指标的影响

由表4可见，随CTS添加水平的增加，吉富罗非鱼血清ALB逐渐升高，但各处理组间均无显著差异（P＞0.05）；BUN、GPT和GOT随CTS添加水平升高而逐渐降低，Cd+1.0%CTS组和Cd+1.5%CTS组的BUN水平和GPT活性显著低于Cd组（P＜0.05），各 Cd+CTS组间无显著差异（P＞0.05）；Cd+CTS组GOT活性显著低于Cd组（P＜0.05），Cd+1.0%CTS组和Cd+1.5%CTS组GOT活性显著低于Cd+0.5%CTS组（P＜0.05），Cd+1.0%CTS组和Cd+1.5%CTS组间差异不显著。

2.4 壳聚糖对饲料镉胁迫下吉富罗非鱼肠道、肌肉、粪便和养殖水体中镉残留水平的影响(见表5)

表5 CTS对饲料镉胁迫下吉富罗非鱼肠道、肌肉、粪便和养殖水体中镉水平的影响

由表5可见，随着CTS添加水平而增加，Cd+CTS各处理组（除Cd+0.5%CTS组外）镉日摄入量均显著高于Cd组（P＜0.05），Cd+CTS各处理组的肠道、肌肉和养殖水体中镉的残留水平呈明显下降趋势，且显著低于Cd组（P＜0.05），而粪便中镉水平呈明显上升趋势，且显著高于Cd组（P＜0.05）。Cd+CTS各处理组的肠道和肌肉镉残留水平，除Cd+1.5%CTS组显著低于Cd+0.5%CTS组外（P＜0.05），其他Cd+CTS处理组间差异不显著（P＞0.05）；而Cd+CTS各处理组间的粪便和养殖水体镉水平间存在显著差异（P＜0.05）。

3 讨论

罗非鱼体内几丁质酶活性很弱，对CTS的分解十分有限，大部分CTS随粪便排出体外[12]；CTS在中性偏碱性环境中对镉具有较强的吸附能力[5,13]，这与吉富罗非鱼肠道内pH值7.2～8.3范围比较接近[14]，并且壳聚糖还可延长饲料在动物肠道中停留的时间[15]。因此，壳聚糖在吉富罗非鱼肠道内存在发生吸附作用的理论基础。从本试验结果看，从不同组织、粪便及养殖水体中镉水平的变化情况来看，随着CTS添加水平的增加，与Cd组相比，Cd+CTS处理组镉日摄入量分别增加8.27%、52.53%和53.53%；肠道镉残留水平分别降低54.7%、67.3%和75.2%；肌肉镉残留水平分别降低46.2%、63.2%和89.6%；粪便中镉残留水平分别升高45.8%、116.3%和152.2%；而养殖水体中镉残留分别降低27.4%、37.8%和52.4%。值得注意的是，粪便中镉水平增加的幅度远远大于镉日摄入量增加的幅度，且养殖水体中的镉水平未随着排除粪便中镉水平的增加而升高，这说明壳聚糖在吉富罗非鱼肠道内发生了吸附作用。研究表明，壳聚糖分子链中存在大量带孤对电子的活性基团(主要是-NH2、-OH)，这些基团上的孤对电子可投入到重金属离子的空轨道中，通过配位键与重金属离子结合，从而形成稳定螯合聚合物[16]。王志华等[17]认为，-NH2是壳聚糖吸附镉的活性基团，-OH不参与吸附反应，在吸附过程中2个氨基与1个镉离子可通过电价配键形成稳定的电价络合物。

研究表明，罗非鱼消化酶活性、血清生化指标等方面的毒性随饲料镉水平增加而增加，生长受到抑制[9，18]。本试验中，在饲料镉胁迫下添加CTS后，肠道蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性都有不同程度的提高，其中蛋白酶的活性在各CTS添加水平下都得到了显著改善；血液生化指标中GPT和GOT水平的降低代表肝脏功能的改善，BUN水平的降低表明了蛋白质利用程度的提高，ALB水平未显著改变，也显示了免疫功能也得到了一定程度的改善。上述生理指标的改善很可能与CTS在肠道内吸附饲料镉减少体内蓄积和增加排出体外有关。目前，通过减少饲料镉在鱼体肠道的吸收或增强机体抗氧化能力来缓解其毒害作用是主要的营养策略[18-20]。已有利用硅酸盐纳米级微球LSN分别吸附饲料镉[18]、饲料铅[19]的报道，发现饲料中添加LSN可减少鱼体组织重金属的残留量，提高消化酶活性，增强抗氧化能力，改善血清生化指标。研究表明，在虹鳟饲料中添加3%CTS可有效降低肝脏中镉残留水平[21]。Zhai等[20]通过在饲料铅胁迫下的罗非鱼饲料中添加800 mg/kg槲皮素，提高机体抗氧化水平而显著改善饲料铅对生长的抑制作用。

进入鱼体的CTS一部分与镉结合排出体外，其他部分可被降解为低聚糖，并发挥其它生物学活性来提高鱼肠道消化酶活性[22-23]、改善血清生化指标[24-26]、提高肝胰脏抗氧化能力[27]，从而达到促生长的效果。研究表明，饲料中添加CTS可提高异育银鲫[22]、花鲈[28]、军曹鱼[29]、草鱼[30]、鲤鱼[23,31]、虹鳟[32]、吉富罗非鱼[33]等的生长性能。

综上所述，在饲料镉慢性胁迫下，CTS能够提高吉富罗非鱼生长性能、肠道消化酶活性、改善血液生化指标，这是CTS发挥生物学活性和吸附作用的共同结果。但从各处理组肠道、肌肉、粪便和养殖水体中镉残留水平的变化，以及CTS对饲料镉致吉富罗非鱼急性毒性的减轻程度来看，我们认为CTS在肠道吸附饲料镉起主要作用。关于CTS吸附特性和其生物学活性这两方面分别在减轻饲料镉毒性过程中发挥作用的具体情况，还有待于深入研究。