辐射旁效应中的信号分子研究进展*

李 源 综述，王小春 审校

(北京协和医学院中国医学科学院放射医学研究所，天津 300192)

自1992年Nagasawa和Little发现当只有1%的细胞接受α粒子照射时，30%的细胞发生姐妹染色单体互换后，辐射诱导的旁效应现象在多种细胞系中被发现，包括成纤维细胞、淋巴细胞、内皮细胞及各种肿瘤细胞。电离辐射诱导的旁效应随着应激信号的传递而不断发展。一方面，通过照射细胞和旁效应细胞之间的直接接触，由间隙连接细胞间通讯(GJIC)传递。另一方面，可溶性的损伤信号或应激信号(如活性氧、NO、细胞因子，胞外DNA等)通过被动扩散与旁效应细胞或质膜上受体相互作用。本文就辐射旁效应中几个重要的信号分子做一简要综述。

1 细胞间隙通讯与辐射旁效应

GJIC在暴露于低剂量α粒子照射的单层融合培养细胞的旁效应中发挥重要的调节作用［1］。间隙连接由跨越相邻细胞两层质膜的完整细胞间通道组成。每个连接子是多个连接蛋白亚基组成的多聚体［2］。Connexin43是间隙连接中重要的蛋白，嵌合在磷脂双分子层内，决定了间隙连接的渗透性和对通过物质的选择性［3］。通常这些孔道允许通过的最大分子量为1 000～1 500Da，允许离子、小分子代谢物和第二信使在细胞间直接交流［4］。如重要的第二信使钙离子，能够产生旁效应信号，并且在旁效应共培养实验中发挥作用。钙离子信号释放进入旁效应细胞的方式就是通过GJIC［5］。

Hei等人发现，connexin43基因启动子区存在AP-1(激活蛋白)和NF-κB转录因子结合位点。直接受照细胞释放的细胞因子，如:肿瘤坏死因子(TNF-a)、转化生长因子 -β1(TGF-β1)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素-8(IL-8)激活旁效应细胞中的NF-κB，诱导环氧合酶-2(COX-2)和一氧化氮合酶(iNOS)基因表达，同时诱导connexin43的表达［6-7］。此外，种种研究结果显示，受低剂量α粒子照射细胞的GJIC与氧化代谢相关。Mancuso等人的研究发现，致癌辐射损伤通过GJIC传递至未受照的小脑组织，这一过程涉及ATP的释放和connexin43表达量的上调［8-9］。Autsavapromporn等人最近的研究也证实，氧化应激与GJIC存在协同作用，并且提出二者在调节受α粒子或γ射线照射的人体成纤维细胞辐射损伤修复过程中发挥重要作用［10］。另外，当使用间隙连接抑制剂处理细胞或在connexin43基因缺陷的细胞中，电离辐射诱导的旁效应被削弱［11］。以上实验表明，辐射旁效应的产生依赖于GJIC，又不仅仅由间隙连接通道介导，还可以通过其他机制(如旁分泌)诱导产生［12］。

2 可溶性因子与辐射旁效应

另一种旁效应信号传递途径即受照细胞释放可溶性因子进而转移至旁效应细胞。研究发现，这些可溶性因子大小介于1 000～10 000kDa之间，包括脂质过氧化物、次黄嘌呤及细胞活素类，如白细胞介素6(IL-6)、IL-8、TGF- β1、TNF- α、活性氧(ROS)及活性氮(RNS)等［13］。

2．1 ROS 和RNS

ROS和RNS是多种细胞自然程序(如细胞凋亡、细胞生长、细胞信号转导、免疫反应和炎症反应)中的关键分子。由于氧化代谢失调和慢性炎症反应，受照细胞及旁效应细胞中活性自由基的水平升高，从而影响致癌过程。Gollapalle等人的研究发现，受照数周后，非靶组织中产生高水平的氧化应激，并诱导聚集的DNA损伤［14］。而使用抗氧化剂处理细胞后，旁效应细胞中的DNA损伤减少。线粒体是自由基的主要产生者，研究发现，在线粒体缺陷型细胞或线粒体DNA突变型细胞中，辐射旁效应被削弱，表明线粒体在辐射旁效应中至关重要［15］。因此，线粒体功能缺陷，可能导致一系列疾病(如癌症)的发生。

大量的证据表明，ROS通过一系列级联反应参与细胞外及细胞内旁效应的诱导［16］。ROS可以直接由受照细胞的辐射分解产物产生，或者间接经由炎症过程产生，通过被动扩散、主动运输或间隙连接转移至临近旁效应细胞［1］。大多数ROS的半衰期很短，仅能诱导距离DNA链几纳米内的损伤;而过氧化氢具有相对更长的半衰期，能自由地穿过细胞膜，长距离迁移，导致远位DNA损伤［17］。高浓度的ROS通过细胞氧化应激反应诱导细胞凋亡甚至坏死。另外，羟基自由基和部分单线态氧分子能与DNA、蛋白质和脂类发生反应，使其功能发生改变［18］。另有证据显示，质膜结合的NADPH氧化酶诱导胞内ROS含量的增加［13］。另一方面，在旁效应细胞，COX-2通过对应的细胞因子受体的活化，调节前列腺素E2的合成，并伴随产生大量活性氧，释放至细胞外环境，与临近细胞相互作用，增强辐射旁效应［6-7］。

RNS，尤其是NO，作为一个重要的信号分子，参与多条信号转导通路。Shao等人的研究表明，当只有1%的细胞直接接受氦离子照射后，40%的细胞中NO水平升高［19］。进一步的研究显示，加入特定的NO清除剂时，旁效应被抑制。而使用钙离子阻滞剂后，旁效应消失，表明钙离子能够调节NO诱导的旁效应［20］。以上实验结果显示，抑制NO合成酶导致钙离子通道被抑制，表明NO参与诱导辐射旁效应。Dickey等人的研究也发现，使用NO清除剂和NO合成酶抑制剂处理细胞都会导致旁效应细胞中DNA双链断裂水平降低［21］。Shao等人的另一项研究发现，射线诱导的NO的合成可以调节受照的人唾液下腺(human salivary gland，HSG)细胞对未受照淋巴瘤细胞的效应，这种调节过程依赖于HSG细胞接受的照射剂量和传线能密度［22］。另有研究表明，NO参与淋巴瘤细胞、恶性胶质瘤细胞培养基介导的辐射旁效应，并且可能诱导邻近细胞早期DNA损伤［4］。对未受照野生型(wt)p53的成胶质细胞瘤细胞的研究表明，无论其与受照的突变型p53细胞共培养或暴露于条件培养基，作为氧化应激的应答，NO均可诱导野生型细胞中p53和热体克蛋白72(hsp72)的表达。这一结果表明，NO可以诱导并调节旁效应，并且NO由受照细胞转移至旁效应细胞过程中不需要直接的细胞间接触(如间隙连接等)［23-24］。

2．2 丝裂原活化蛋白激酶

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是一组能被不同的细胞外刺激激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，参与细胞因子、趋化因子和有丝分裂原等分子经由受体的信号传递。细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)是将信号从表面受体传递至细胞核的关键。磷酸化激活的ERK1/2由胞质转移到核内，进而介导 NF-κB，Ap-1 等转录因子的活化［25］。研究发现，受照细胞中加入PD98059(一种特异性的MAPK激酶的抑制剂)后，旁效应的诱导被削弱，表明MAPK信号通路参与RIBE的诱导。以上结果表明，TGF-β、IGF、IL-1、IL-8 等配体结合到与其相互作用的受体，通过激活MEK(MARK/ERK激酶)1/2、MKK(MARK激酶)3/6或p38信号通路，进而诱导COX-2的表达［26］。研究表明，TNF-α也能够通过AP-1转录因子激活MAPK通路，进一步上调COX-2及iNOS的表达，刺激NO的生成［27］。

2．3 细胞因子

由于电离辐射诱导的旁效应的一些特征与炎症过程类似，因此细胞因子可以间接地进一步增强氧化应激在电离辐射诱导的旁效应中的作用。

具体而言，细胞因子(如 TNF-a、IL-1β、IL-33等)由受照细胞释放，通过膜受体结合到旁效应细胞，直接激活转录因子NF-κB。NF-κB负责iNOS和COX-2基因的表达，其中COX-2参与ROS的产生，而iNOS控制NO的合成［6-7］。

另外，IL-6与其旁效应细胞表面上的受体结合，可以激活JAK2信号转导分子和信号传导及转录激活因子-3(signal transducers and activators of transcription，STAT-3)通路。反过来，STAT-3的激活导致活化的NF-κB在细胞核中长时间滞留，调控旁效应细胞中COX-2基因的表达和最终ROS的含量［28-29］。

TGF-β1由射线诱导或经由NO诱导产生。它可以增加ROS的合成和微核形成，且TGF-β1抑制剂能够减轻辐射旁效应［30］。具体而言，受照细胞分泌的TGF-β1参与旁效应诱导的NAD(P)H氧化酶的活化，导致胞内ROS含量增加［13］。TGF-β1和IL-8，也可以激活MAPK通路，使旁效应细胞产生自由基［31］。另外，Shao等人的研究证实 TGF-β1是辐射诱导的NO的下游产物，且NO与TGF-β1两种信号分子相互依存。当部分靶细胞受照时，NO及其下游产物TGF-β1由靶细胞释放。一旦TGF-β1与未照射细胞相互作用，即可通过依赖于Ca2+的途径诱导胞内第二旁效应信号NO生成，并进一步诱导邻近细胞微核形成［32］。体外实验表明，TGF-β1诱导DNA损伤与条件培养基对细胞DNA损伤的程度类似［30］。同样，与旁效应相似，TGF-β1可以诱导DNA合成酶缺陷型细胞的DNA损伤［33］。另外，最近的研究显示，受照后，旁效应细胞中 TGF-β1及 TGF-β 受体的表达水平升高［34］。综上所述，TGF-β1通过刺激ROS的合成或通过依赖于Ca2+的途径诱导NO的合成参与辐射旁效应。

另一方面，作为DNA损伤的应答，旁效应细胞的氧化应激在其生存的“炎症”环境下还可能激活野生型p53，以不依赖于NF-κB的方式上调黏附分子的表达［35］。

2．4 胞外 DNA

胞外DNA是一种独立于细胞外的游离DNA，广泛存在于体液中。最近，Ermakov和Glebova等人提出垂死的受照细胞释放其受损DNA片段至胞外，并作为全身性应激信号参与辐射旁效应的进展［36-37］。

对于受照细胞，在氧化应激条件下，胞内DNA的氧化修饰水平和细胞死亡率增加［36］，诱导细胞凋亡并释放出受损的、氧化的胞外DNA至培养基。接着，拥有应激信号功能的氧化的胞外DNA与受体相互作用，导致旁效应细胞的表面或内部发生次级氧化应激。旁效应细胞中氧化的胞外DNA的受体可能是Toll样受体家族的跨膜蛋白TLR9［38］，DNATLR9复合物形成之后，通过下游信号通路激活促炎转录因子 IRF3和 NF-κB［37］，诱导 ROS的合成，而NO的生成量减少，同时，DNA单链和双链断裂数瞬时增加。

在旁效应细胞中，氧化应激导致基因组和线粒体的氧化损伤，并且激活DNA损伤应答途径。然而，部分旁效应细胞由于触发细胞级联凋亡而趋向死亡，这又导致氧化的胞外DNA释放并作为应激信号进一步促进旁效应的传播［16］。

值得注意的是，未受照细胞释放的胞外DNA不能作为氧化应激信号，也不能诱导细胞的ROS合成［36］。

3 结语

自从X射线被发现的一个多世纪以来，射线对DNA的直接损伤如突变或癌变等各种效应已被广泛接受。同时，受照的肿瘤细胞释放有活性的信号分子，进一步影响邻近及远位的肿瘤细胞或正常细胞。氧化应激和随即产生的DNA损伤在辐射诱导的旁效应的发展中发挥重要作用。这种氧化应激效应促进旁效应信号的传播，同时，通过炎症反应进一步增强其作用。癌基因诱导复制应激，进而导致旁效应增强、DNA损伤应答及修复机制缺陷，可能作为诱裂因子进一步发挥作用。辐射产生的DNA氧化损伤可能产生治疗效果，也可能造成有害效应。换句话说，放射治疗可以杀死肿瘤细胞，也可能对正常组织或细胞造成损伤，导致DNA双链断裂及其他DNA损伤的累积，可能促进放疗患者基因组不稳定，并且增加二次癌变的危险性，同时降低肿瘤治疗尤其是现代高LET粒子治疗的效率。因此，对辐射旁效应分子机制更好的理解有助于对低剂量照射可能导致肿瘤的风险进行准确的评估，建立最优化模型。电离辐射旁效应对辐射防护理论提出了新的观点，也对放射防护技术提出了新的要求。

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