胰岛素样生长因子诱导人肺成纤维细胞增殖和分化

陈刚　王国栋★　王乃辉

胰岛素样生长因子诱导人肺成纤维细胞增殖和分化

陈刚王国栋★王乃辉

目的 探讨胰岛素一号增长因子（IGF-I）对人肺成纤维细胞（HLF）的增殖和分化的影响及其作用机制。方法 采用浓度为100 ng/ml的IGF-I单独处理细胞96 h或用浓度为100 ng/ml的IGF-I和浓度为3μM、5μM和10μM的LY294002 共同处理细胞96h；MTT法检测细胞增殖；western blot法检测α-SMA、PI3K、Akt和p-Akt的表达量；试剂盒检测胶原蛋白含量。结果 IGF-I单独处理可促进细胞增殖（P＜0.05），上调胶原蛋白和α-SMA的表达（P＜0.05），活化PI3K/Akt信号通路；IGF-I和LY294002 共同处理后，IGF-I促细胞增殖的作用、对胶原蛋白和α-SMA表达的促进作用及对PI3K/Akt信号通路的活化作用均可被LY294002抑制。结论 IGF-I可通过PI3K/Akt信号通路促进 HLF的增殖与分化。

胰岛素样生长因子-1 PI3K/Akt 人肺成纤维细胞 分化

特发性肺纤维化（Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种病因不明，以基质异常堆积和肺泡结构紊乱为主要特征，最终导致肺间质纤维化的一种肺间质性疾病［1，2］。IPF发病机制目前尚未明确。IPF患者的生存率较低，5年内存活率仅有20%［3］。肌成纤维细胞（Myofibroblast s，MF）在IPF发生发展过程中起重要作用，而MF可由肺成纤维细胞增殖分化而来［1］。目前已发现包括转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）在内的多种细胞因子可促进人肺成纤维细胞（H uman Lung Fibroblasts，HLF）向MF的转化［4］。胰岛素样生长因子（insulin-like growth factors，IGFs）是一类多功能的细胞调控因子，其通过调节下游的信号通路促进细胞的增殖和分化［5，6］。研究发现IGFs和TGF-β在促进肺成纤维细胞分化的过程中具有协同作用。本资料旨在通过对HLF分化水平和IGFs下游信号通路的检测，探讨 IGFs对离体培养的HL F向MF分化的影响及其可能作用机制。

1　材料与方法

1.1材料 HLF由实验室保存；胰蛋白酶，胰岛素一号增长因子（IGF-I），LY294002，MTT，DMSO（美国Sigma公司）；胎牛血清，DMEM培养基（美国GIBCO公司）；Sircol Soluble Collagen Assay（英国Biocolor公司）；α-SMA一抗（丹麦DAKO公司）；TGF-β1（美国Ch emicon公司）； RIPA细胞蛋白裂解液（上海科致生物科技有限公司）；BCA总蛋白定量试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）；Akt一抗，p-Akt一抗（美国Beverly公司）；PI3K一抗（美国signalway antibody公司）；β-actin一抗，HRP-IgG（北京博奥 森生物技术有限公司）。

1.2方法 （1）HLF的培养与传代：冻存的HLF细胞复苏后用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基于37℃，5% CO2条件下培养，当细胞密度达80%～90%时用0.25%的胰蛋白酶消化并进行传代。取生长 状态良好的细胞以1×105个/ml接种于6孔板中，待细胞贴壁后换无血清培养基继续培养24h。（2）IGF-I 对HLF向MF分化的影响：细胞用无血清培养基培养24 h后分为3组，分别做如下处理：阴性对照组（未做任何处理）；阳性对照组（加TG F-β1 5 ng/ml）；观察组（ 加IGF-I 10 0 ng/ml）；处理后无血清培养基继续培养96 h。 （3）LY294002对IG F-I诱导作用的影响：细胞采用无血清培养基培养 24 h后分为空白对照组（未处理），阳性对照组（加IGF-I 100ng/ml），阴性对照组（加LY294002 5μM）和观察组（分为三个处理组，IGF-I 100 ng/ml+LY294002 3μM，IGF-I 100 ng/ml+LY294002 5 μ M，IGF-I 100 ng/ml+LY294002 10μM）；处理后无血清培养基继续培养96 h。（4）MTT法检测细胞增殖：细胞用PBS清洗3次，后加 入180μl无血清培养基和20μl的MTT（0.01mol/L），继续培养4h；吸去培养基，加入150μl的DMSO，摇床10min；570 nm处测OD值。（5）胶原蛋白检测：采用Sircol Soluble Collagen Assay试剂盒检测总胶原蛋白量。1000r/min离心10 min弃去上清液得到胶原-染料复合物，复合物用碱性溶剂溶解后用酶标仪测540nm吸光值。（6）western检测蛋白表达：细胞中的蛋白质利用RIPA细胞蛋白裂解液提取，BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE（上样量为30μg）分离后60 V，2 h电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，分别用α-SMA（1：1000）、PI3K（1∶1000）、Akt（1∶100）、p-Akt（1：1000）和β-actin（1∶500）一抗室温孵育2.5 h，TBST洗涤3次，HRP-IgG（1∶2000）室温抚育2h，TBST洗涤3次，暗室曝光。

1.3统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1IGF-I对HLF细胞增殖的影响 HLF与细胞因子共培养96 h后，与对照组比较，TGF-β1和IGF-I均可促进HLF细胞的增殖，分别提高了80%和63%，差异均有统计学意义（P＜0.05）；IGF-I对细胞增殖的促进作用低于TGF-β1，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2IGF-I对HLF细胞分化的影响 为检测IGF-I对HLF细胞分化的影响，HLF细胞与IGF-I共培养96h。与阴性对照组比较，阳性对照组TGF-β1和观察组IGF-I中平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和胶原蛋白的含量均显著增加（P＜0.05），说明IGF-I可促进HLF细胞分化为MF细胞，但促分化效果低于TGF-β1。

2.3IGF-I对PI3K/Akt通路的影响 与空白对照组比较，阳性对照组和IGF-I组中PI3K的表达量及 Akt的活性均显著上调（P＜0.05），说明IGF-I可活化PI3K/ Akt信号通路；但IGF-I对此信号通路的活化作用低于阳性对照TGF-β1。

2.4LY294002对IGF-I诱导HLF细胞增殖的影响 上述结果显示，IGF-I可能通过调节PI3K/Akt信号通路的活性来调节细胞的增殖和分化。因此本资料利用PI3 K的特异性抑制剂LY294002来处理细胞，进一步探讨IGF-I的作用机 制。与阳性对照组比较，LY29 4002可显著抑制IGF-I诱导的HLF细胞增殖（P＜0.05），并存在剂量依赖性。

2.5LY294002对IGF-I诱导HLF细胞分化的影响 检测Akt活性发现，与空白对照组比较，LY294002不影响Akt的活化（P＞0.05）；与 阳性对照比较，LY294 002作用浓度为10μM时可显著抑制IGF-I诱导的Akt的活化（P＜0.05）。检测细胞分化发现，与阳性对照组比较，LY294002在作用浓度为10μM时可显著抑制IGF-I诱导的胶原蛋白的表达（P＜0.05）；同时，IGF-I对α-SMA的诱导作用亦被显著抑制（P＜0.05）；说明LY294002可抑制IGF-I诱导的HLF细胞向MF细胞的分化。

3　讨论

IPF是一类肺间质疾病，主要特征为成纤维细胞/ MF在肺泡壁的聚集及基质的异常沉积引发肺泡结构破坏及肺功能的损伤［7］。MF在IPF发生发展过程中起决定性作用。MF细胞的主要特征为可合成丰富的胶原蛋白及细胞外基质蛋白和α-SMA［8］。MF可由HLF、上皮间质细胞等细胞增殖分化而来。

IGF家族包含两个成员，IGF-I和IGF-Ⅱ。已有报道显示IGF-I在细胞的增殖分化等多方面起作用［6，9］。Hetzel等研究表明IGF-I可影响HLF的增殖及基质蛋白的表达［10］。IGF-I发挥作用的主要方式是与其受体结合之后激活下游信号通路，目前发现的可受IGF-I调控的信号通路包括MEK/ERK和PI3K/ AKT等［11～14］。虽然关于IGF-I促进细胞增殖及分化的报道较多，但关于IGF-I是否在HLF细胞向MF细胞分化过程中起作用及其作用机制目前尚未见报道。

本资料中利用IGF-I刺激HLF细胞，探讨IGF-I对HLF细胞增殖分化的影响；利用PI3K特异性抑制剂LY294002和IGF-I共同处理HLF细胞，探索IGF-I诱导HLF细胞增殖分化的机制。结果显示，IGF-I可刺激HLF细胞增殖，检测MF细胞特异性标志物发现均有显著增加，说明IGF-I可诱导HLF细胞向MF细胞的分化；进一步研究发现PI3K/AKT信号通路中PI3K的表达量及AKT的活性均上调。提示IGF-I可能是通过PI3K/AKT信号通路来调节HLF细胞增殖分化的。为了验证此假设，本资料利用PI3K特异性抑制剂LY294002和IGF-I共同处理HLF细胞，结果表明LY294002可显著抑制IGF-I对HLF细胞增殖的促进作用及IGF-I诱导的HLF细胞向MF细胞的分化。

综上所述，IGF-I可通过激活PI3K/AKT信号通路来促进HLF细胞的增殖并通过上调α-SMA和胶原蛋白的表达进而促进HLF细胞向MF细胞的分化。该结果为了 解IGF-I在IPF中的作用及机制提供理论依据，并为IPF的治疗开辟了一条新的途径。

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3 Vancheri C， Failla M， Crimi N， et al. Idiopathic pulmonary fibrosis： a disease with similarities and links to cancer biology. Eur Respir J， 2010，35（3）： 496～504.

4 Conte E， Gili E， Fruciano M， et al. PI3K p110γ overexpression in idiopathic pulmonary fibrosis lung tissue and fibroblast cells： in vitro effects of its inhibition. Laborato ry Investigation， 2013， 93（5）： 566～576. 5 Xie L， Wang W. Weight control and cancer preventive mechanisms： role of insulin growth factor-1-mediated signaling pathways. Experimental Biology and Me dicine， 2013， 238（2）： 127～132.

6 Ge X， Zhang Y， Jiang H. Signaling pathways mediating the effects of insulin-like growth factor-I in bovine muscle satellite cells. Molecular and Cellular Endocrinology， 2013， 372（1～2）： 23～29.

7 American Thoracic Society/European Respiratory Society International Multidisciplinary Consensus Classification of the Idiopathic Interstitial Pneumonias. This joint statement of the American Thoracic Society （ATS），and the European Respiratory Society （ERS） was adopted by the ATS board of directors， June 2001 and by the ERS Executive Committee， June 2001. Am J Respir Crit Care Med， 2002， 165（2）： 277～304.

8 Coward WR， Saini G， Jenkins G. The pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis. Therapeutic Advances in Respiratory Disease， 2010，4（6）： 367～388.

9 Glass DJ. Skeletal muscle hypertrophy and atrophy signaling pathways. Int J Biochem Cell Biol， 2005， 37（10）： 1974～1984.

10 Hetzel M， Bachem M， Anders D， et al. Different Effects of Growth Factors on Proliferation and Matrix Production of Normal and Fibrotic Human Lung Fibroblasts. Lung， 2005， 183（4）： 225～237.

11 Fernández AM， Dupont J， Farrar RP， et al. Muscle-specific inactivation of the IGF-I receptor induces compensatory hyperplasia in skeletal muscle. Journal of Clinical Investigation， 2002， 109（3）： 347～355.

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13 Sato K， Li Y， Foster W， et al. Improvement of muscle healing through enhancement of muscle regeneration and prevention of fibrosis. Muscle Nerve， 2003， 28（3）： 365～372.

14 Weroha SJ， Haluska P. The insulin-like growth factor system in cancer. Endocrinol Metab Clin North Am， 2012， 41（2）： 335～350.

Objective To investigate the effect and the mechanism of IGF-I on the proliferation and differentiation of Human Lung Fibroblasts. Methods Using IGF-I to stimulate Human Lung Fibroblasts at a concentration of 100ng/ml or stimulating Human Lung Fibroblasts with IGF-I （100ng/ ml）and LY294002 （3μM，5 μM，10μM） for 96h； the proliferation of cells were detected using MTT； the expression of α-SMA，PI3K，Akt and p-Akt were measured though western blot. Results IGF-I separately can promote the proliferation of Human Lung Fibroblasts，up-regulate the expression of α-SMA and collagen，activate the PI3K/Akt signaling pathway； and the promotion can be inhibited by LY294002. Conc lusion IGF-I can induce the pro liferation and differentiation of Human Lung Fibroblasts via PI3K/Akt signaling pathway.

IGF-I PI3K/Akt Human Lung Fibroblast Differentiation

572000 海南三亚 中国人民解放军第425医院呼吸内科