木薯淀粉合酶SSⅠ结构与功能的分析及预测

薛晶晶　李开绵　陈松笔

摘要：木薯（Manihot esculenta Crantz）是重要的工业淀粉原料和生物质能源作物，贮藏根富含淀粉。淀粉合酶是淀粉合成的关键酶，在淀粉合成中起着重要作用。采用生物信息学方法，以木薯淀粉合酶I为研究对象，对其氨基酸序列、甲基化、导肽、跨膜拓朴结构、疏水性亲水性、磷酸化位点、亚细胞定位、蛋白质二级结构与功能域进行分析和预测。结果表明，淀粉合酶SS在不同植物中的氨基酸序列差异性较大，但仍然具有一定的保守性氨基酸残基，其氨基酸序列的功能结构域是一致的，表明淀粉合酶在植物中具有一定的保守性，与其在植物中的重要作用密切相关，为木薯淀粉合酶深入研究提供生物信息学的参考数据。

关键词：木薯（Manihot esculenta Crantz）；淀粉合酶I；结构与功能；生物信息学

中图分类号：S533 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）22-5552-06

木薯（Manihot esculenta Crantz）隶属于大戟科（Euphorbiaceae）木薯属（Manihot P. Mill.）多年生灌木状植物[1，2]，原产于美洲热带，是世界三大薯类作物之一。木薯贮藏根淀粉含量在27%～34%之间，被誉为“淀粉之王”，是世界热带地区继水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、高粱[Sorghum bicolor（L.）Moench]之后的第四大粮食作物，为热带、亚热带7亿多人口提供了基本食粮，是我国热带和南亚热带地区推广的重要生物质能源作物，也是我国重要的工业淀粉原料和潜在的粮食作物[3]。

淀粉在人类生活中起着举足轻重的作用，植物淀粉合成主要是在ADPG焦磷酸化酶（Adenosine 5-diphosph ate glucose pyrophosphorylase，AGPase）、淀粉合酶（Starch synthase， SS）、淀粉分支酶（Starch-branching enzyme， BE）和淀粉去分支酶（Starch debranching enzyme， DBE）等酶的催化下完成[4]，这些酶在淀粉合成中扮演着不同的角色。SS是以寡聚糖为前体，腺苷二磷酸葡萄糖（ADP-Glc）为底物，通过α-1， 4键连接，将ADP-Glc上的葡萄糖（Glc）连到寡聚糖上，形成直链淀粉或分支淀粉的延伸分支链。根据提取液中与淀粉粒的结合程度，SS分为颗粒结合淀粉合酶（Granule bound starch synthase， GBSS）与可溶性淀粉合酶（Soluble starch synthase， SSs）。GBSS主要参与直链淀粉的合成，抗性淀粉的含量与淀粉中直链淀粉的比例相关，淀粉的结构变化也会影响淀粉在人体肠道的消化率[5]。SSs主要发生于质粒的基质空间，与天然淀粉密切相关，并参与支链淀粉中分支链的合成。SSs具有许多同工酶，如SSⅠ、SSⅡ、SSⅢ和SSⅣ等，在支链淀粉合成中发挥着不同的作用[6]。SSI被柠檬酸盐激活，加入糖原反应活性最大，主要负责延伸A和B1链，当达到不适于SSⅠ催化的临界链长时，转由其他SS继续延伸或由SBE产生分支[7]。此外，不同作物的SS基因在淀粉合成中所发挥的作用也不同[8，9]。因此，了解淀粉合酶在木薯块根淀粉合成中的作用可以为木薯块根淀粉的研究提供依据。

本研究利用生物信息学的方法，以木薯淀粉合酶同工酶Ⅰ（Starch synthase isoformⅠ，SSⅠ）为研究对象，同时对淀粉含量较高的小麦（Triticum aestivum Linn.）、大麦（Hordeum vulgare L.）、小米（Setaria italica）、玉米、马铃薯（Solanum tuberosum）、甘薯（Dioscorea esculenta）、高粱、大豆（Glycine max）、蓖麻（Ricinus communis L.）以及模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻等SSI基因及相应氨基酸序列的组成成分、理化性质、结构特征、功能等比对分析，以期为木薯淀粉合酶的深入研究提供生物信息学方面的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究中数据均来源于NCBI核苷酸及蛋白质数据库，包括：木薯SSⅠ基因（GenBank： ABV25893.1）、小麦SSⅠ基因（GenBank： CAB99209.1）、大麦SSⅠ基因（GenBank： AAF37876.1）、小米SSⅠ基因（NCBI Reference Sequence：XP_004964777.1）、玉米SSⅠ基因（GenBank： AFW85727.1）、马铃薯SSI基因（GenBank： CAA41359.1）、甘薯SSⅠ基因（GenBank： AAA86423.1）、高粱SSⅠ基因（GenBank： AAD45815.2）、大豆SSⅠ基因（NCBI Reference Sequence： XP_003523360.1）、蓖麻SSⅠ基因（GenBank： EEF37952.1）、拟南芥SSⅠ基因（GenBank： AED93282.1）和水稻SSⅠ基因（GenBank： BAA03739.1）。

1.2 方法

利用DNAMAN（Version6.0）等软件及NCBI、CyMate、TMHMM Server v. 2.0、ExPaSy及NetPhos 2.0 Server等生物信息学软件进行在线分析。

核苷酸及氨基酸序列、理化性质、开放阅读框（Open reading frame，ORF）的查找和翻译等利用ExPaSy-ProtParam tool及ORFFinder等在线工具进行；核酸及氨基酸序列的相似性比对及系统进化关系利用DNAMAN软件来完成；核苷酸序列胞嘧啶甲基化位点采用CyMate网站进行分析；蛋白质导肽的预测、跨膜结构域及亲水性/疏水性的分析利用在线工具TargetP 1.1 Server、TMHMM Server，v.2.0、ExPaSy-ProtScale完成；蛋白质二级结构的预测利用SOPMA SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD在线工具完成，并通过英国Sanger中心Pfam数据库比对分析其功能结构域；同时，利用NetPhos 2.0 Server对蛋白质磷酸化位点进行预测和分析。endprint

2 结果与分析

2.1 核苷酸、氨基酸序列及生化特性分析

以小麦、大麦、小米、玉米、马铃薯、甘薯、高粱、大豆、蓖麻、拟南芥、水稻为对照，采用ProtParam tool分析NCBI数据库中有关木薯淀粉合酶的基因和蛋白质信息，结果如表1所示。由表1可知，木薯与上述11种植物的氨基酸残基数基本一致，分子质量也相差不多；但理论等电点（pI）在这些植物中差别很大，甘薯和蓖麻偏碱性，而其余植物的理论pI均偏酸性；氨基酸序列中含量最为丰富的氨基酸存在一定的相似性。这些植物的酸性和碱性氨基酸比例、总氨基酸带电荷比例、极性氨基酸比例、疏水性氨基酸比例基本一致。用ProtParam tool分析这些植物的蛋白质稳定性，除小米和水稻外，其余的均属于稳定类蛋白。

2.2 核苷酸序列胞嘧啶甲基化分析

DNA甲基化是主要的表观遗传修饰形式，在植物基因表达、细胞分化以及系统发育中起着重要的调节作用。发生在基因启动子区的胞嘧啶甲基化抑制其基因的转录，但发生在基因编码区的胞嘧啶甲基化一般不影响其表达[10]。DNA甲基化在基因元件上的分布特征和表达特点反映了其在基因表达中的重要调控作用[11]。本研究利用CyMate（http：//www.cymate.org/）在线生物信息学软件，对木薯SSI基因的编码区域（1 902 bp）可能发生甲基化的胞嘧啶进行分析，结果如图1与表2所示。木薯SSI基因编码区的胞嘧啶甲基化较少，对其他植物分析也得到相似的结果。

2.3 氨基酸序列同源性分析

利用DNAMAN软件对木薯及其他植物淀粉合酶的氨基酸序列进行同源性比对及系统进化树分析，结果如图2所示。由图2可以看出，SS基因在不同植物中编码的氨基酸序列具有较大的差异，但仍存在保守的氨基酸残基，这可能是上述植物中淀粉合酶的共性。木薯与小麦、大麦、小米、玉米、马铃薯、甘薯、高粱、大豆、蓖麻以及拟南芥、水稻的相似性分别为85%、85%、84%、85%、55%、55%、84%、80%、57%、78%及85%。对木薯淀粉合酶及其他植物的系统进化关系进行分析，这12种植物可以划分为3大类（图3），与木薯亲缘关系最近的植物是拟南芥，其次是大豆，而亲缘关系最远的是同为大戟科植物的蓖麻。

2.4 氨基酸序列导肽的预测与分析

蛋白质只有装配成结构和功能的复合体，并位于正确的细胞部位，才能参与细胞的生命活动。导肽是一段引导新合成的肽链进入细胞器的识别序列[12]。因此，对氨基酸序列导肽的预测和分析，对了解蛋白质的亚细胞定位与功能可提供一定的帮助。利用TargetP 1.1 Server在线软件对木薯及其他11种植物氨基酸序列的导肽进行预测，结果如表3所示。由表3可以看出，淀粉合酶SSI蛋白质序列在木薯中存在线粒体转运肽，而在其他植物中均存在叶绿体转运肽，其中木薯的可信度最低为4级，马铃薯的可信度最高为1级，其他植物的可信度多为2级。结果表明，所有植物淀粉合酶的蛋白质序列都具有导肽，木薯中的淀粉合酶是线粒体导肽酶切位点，而其他植物是叶绿体导肽酶切位点。

2.5 跨膜结构域的预测和分析

跨膜结构域是膜中蛋白质与膜脂相结合的主要部位，一般由20个左右的疏水氨基酸残基形成α-螺旋，固着于细胞膜上起“锚定”作用[12]。预测和分析蛋白质的跨膜结构域，对于了解其结构、功能以及细胞中的作用部位具有重要意义。利用TMHMM Server v. 2.0在线软件对木薯淀粉合酶SSⅠ的氨基酸序列的跨膜结构域进行预测[13]，结果如图4所示。由图4可以看出，木薯淀粉合酶SSⅠ的整条肽链都位于膜外，不存在跨膜结构域。对小麦、大麦、小米、玉米、马铃薯、甘薯、高粱、大豆、蓖麻、拟南芥及水稻的跨膜结构域进行预测，得到了相似的结果。

2.6 氨基酸疏水性/亲水性的预测和分析

氨基酸的疏水性（亲水性）是蛋白质固有的特性，决定蛋白质的三维空间构象。预测和分析蛋白质的疏水性/亲水性，是蛋白质二级结构预测以及功能域划分的一个重要过程[14]。用ProtScale在线软件预测木薯淀粉合酶SSⅠ氨基酸序列的疏水性/亲水性的结果如图5所示。由图5可以看出，多肽链第64位的Glu具有最低的分值（-3.322），亲水性最强；第276、277位的Pro、Val具有最高的分值（2.378），疏水性最强。但从整体来看，亲水性氨基酸均匀分布在整个肽链中，且存在一个明显的亲水区域。因此，木薯淀粉合酶SSⅠ整条多肽链表现为亲水性。对小麦、大麦、小米、玉米、马铃薯、甘薯、高粱、大豆、蓖麻、拟南芥以及水稻的疏水性/亲水性进行预测，结果与木薯一致。

2.7 蛋白质二级结构的预测和分析

蛋白质分子的多肽链通常折叠和盘曲成比较稳定的空间结构，以形成特有的生物学活性和理化性质[15]，因此，分析蛋白质二级结构对了解其空间结构具有重要意义。蛋白质二级结构是指多肽链中主链原子以氢键构成的局部空间排布，其常见的结构元件主要有α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲等。

利用SOPMA SECONDARY STRUCTURE PRE

DICTION METHOD在线软件预测木薯淀粉合酶SSⅠ氨基酸序列的二级结构[16，17]，结果如图6所示。由图6可以看出，α-螺旋和无规则卷曲是其主要的结构元件，而β-转角和延伸链则散布于整个蛋白质中。该氨基酸序列由37.91%的α-螺旋、15.48%的延伸链、6.79%的β-转角和39.81%的无规则卷曲组成。对小麦、大麦、小米、玉米、马铃薯、甘薯、高粱、大豆、蓖麻、拟南芥以及水稻的二级结构进行预测，结果与木薯一致。

2.8 蛋白质功能结构域的预测和分析

结构域（Domain）是指蛋白质中能折叠成特定三维结构的一段区域，其结构亚单位称为模体（Motif），通常由2～3个二级结构单位组成，包含40～300个氨基酸残基，三维空间可以明显区分且相对独立，并往往具有一定的生物学功能[18]。采用英国Sanger中心Pfam 27.0在线软件分析木薯淀粉合酶SSⅠ氨基酸序列的功能结构域，结果如图7所示。由图7可以看出，该氨基酸序列具有两个重要的功能域：氨基酸序列第124-382肽段与淀粉合酶催化功能区段相匹配；而氨基酸序列第440-590肽段与糖基转移酶组功能区段相匹配。对小麦、大麦、小米、玉米、马铃薯、甘薯、高粱、大豆、蓖麻、拟南芥及水稻的二级结构进行预测，结果与木薯一致。endprint

2.9 蛋白质磷酸化位点的预测和分析

蛋白质磷酸化是指由蛋白质激酶催化，将ATP或GTP的γ位磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基（如丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸等）上的过程，是生物体一种重要的调节方式[19]，蛋白质磷酸化反应在细胞信号传递过程中占有极其重要的地位。本研究利用NetPhos 2.0 Server在线软件分析木薯SSⅠ的磷酸化位点，结果如图8所示。由图8可以看出，该蛋白质共有43个磷酸化位点，其中23个丝氨酸位点，10个苏氨酸位点，10个酪氨酸位点。对其他11种植物的分析结果与木薯相似。木薯SSI蛋白质磷酸化是SSI蛋白质翻译后的重要修饰方式。而蛋白质磷酸化修饰位点及其与蛋白质功能关系的研究，将有助于探讨蛋白质翻译后修饰调控的精细机制。

2.10 蛋白质的亚细胞定位

亚细胞定位是指某种蛋白质或表达产物在细胞的具体部位，如细胞核、胞质或者细胞膜等，亚细胞定位对于了解蛋白质功能是非常重要的。本研究利用PSORT在线软件对木薯SSⅠ进行亚细胞定位，结果如图9所示。由图9可以看出，SSⅠ定位于微体（过氧物酶体）的可能性为59%，定位于线粒体基质的可能性为47.5%，于细胞质的可能性为45%，定位于线粒体膜的可能性为18%，根据PSORT及导肽的预测分析，木薯SSⅠ可能是线粒体蛋白，定位于线粒体基质中。

3 小结与讨论

生物信息学的快速发展，为分子生物学的发展提供了有力帮助[20]，更全面的数据库建设、整合和数据挖掘，为基因、蛋白质等深入研究提供了参考；另一方面的结构分析与功能预测更要以生物信息学为基础，利用分子模拟技术结合计算机图形技术可以更形象、更直观地研究蛋白质等生物大分子的结构，蛋白质空间结构更清晰的表述和研究对揭示蛋白质结构和功能的关系、总结蛋白质结构的规律、预测蛋白质肽链折叠和蛋白质结构等，都有极大的帮助和促进。同时，也可以利用生物信息学进行大规模功能表达谱的分析及代谢网络建模分析[21]。

本研究从生物信息学角度，以木薯淀粉合酶SSI为主要研究对象，同时对淀粉含量较高的11种植物淀粉合酶的核苷酸序列及其氨基酸序列结构特征进行分析，对其整条肽链的亲水性、疏水性、亚细胞定位、二级结构等进行了预测，并对其功能结构域进行分析。研究结果表明，淀粉合酶SS在不同植物中的氨基酸序列差异性较大，但仍然具有一定的保守性氨基酸残基，其氨基酸序列的功能结构域是一致的，表明淀粉合酶在植物中具有一定的保守性，与其在植物中的重要作用密切相关。但是木薯及其他植物淀粉合酶的导肽预测结果显示，木薯的导肽为线粒体转运肽，而其他植物均为叶绿体转运肽，这可能是由木薯自身的淀粉合成途径决定的，是木薯淀粉合酶特有的性质。

淀粉合成过程中多种关键酶与淀粉结构的形成及其含量的关系一直是淀粉生物合成的研究热点。而淀粉合酶是这些关键酶中的一种，在不同植物不同时间空间和不同形式类别中的作用极为复杂[22]。淀粉合酶作为淀粉生物合成过程中的关键酶与其他酶相互作用，从而影响淀粉的含量和性质；而这些作用的结果最终会影响植物尤其是农作物的品质。木薯块根淀粉含量是木薯的重要部分，对淀粉合成过程中关键酶的研究是木薯研究的重点领域，目前已经克隆了木薯可溶性淀粉合酶Ⅰ、Ⅱ（SSⅠ、SSⅡ）及颗粒结合淀粉合酶（GBSS）等，而对编码淀粉合酶的不同基因分子进化和功能差异的研究[23]，可以为木薯淀粉合成奠定良好基础。

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（责任编辑 屠 晶）endprint

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