鳖源致病性嗜水气单胞菌的分离与鉴定

林锋　刘莉　曹铮　等

摘要：从患病中华鳖（Pelodiscus sinensis）肺组织中分离到优势菌1株，进行了表型特征分析和16S rDNA序列测定。结果表明，该菌为气单胞菌属的嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila），通过对健康中华鳖进行人工感染，发现该菌具有致病性；选取20种常规药敏试纸进行药敏试验，结果表明，该嗜水气单胞菌对庆大霉素、头孢他啶、头孢西丁、链霉素、呋喃妥因敏感，对诺氟沙星、红霉素、阿米卡星、环丙沙星中敏，对其他11种抗生素具有耐药性。

关键词：鳖（Pelodiscus sinensis）；嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）；16S rDNA；药敏试验

中图分类号：S943 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）22-5487-03

嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）属于弧菌科气单胞菌属，是一种条件性致病菌，广泛存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人类粪便中，对水产动物、畜禽和人类均有致病性[1]。嗜水气单胞菌作为淡水养殖动物重要的病原菌之一，目前已确定淡水鱼类细菌性败血症、鳖“红底板”病等多种病害是由其所导致的[2，3]，给水产养殖业造成极大的经济损失。近年来，抗生素的普遍使用导致了嗜水气单胞菌的耐药性也日趋严重[4]。因此，本研究通过对患病中华鳖（Pelodiscus sinensis）体内的病原菌分离、16S rDNA序列分析来鉴定病原菌的类别，并利用药敏试验来初步筛选治疗该病症的药物，开展典型性中华鳖病症的研究，有利于针对不同的病症采取有效的治疗措施，降低经济损失。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 2013年4月，取自浙江省湖州市南浔区某中华鳖养殖场外塘，病鳖体重为820 g左右。临床症状为颈部肿大，腹部有气胀感；部分严重者口鼻出血。病理剖检发现肺肿大，部分呈粉红色；肝脾略有肿大，有的呈花斑状；咽喉上皮处有颗粒状的突起。从开始发现到陆续性死亡时间为7～15 d，累积死亡率近70%。

1.1.2 培养基及试剂 营养肉汤干粉、琼脂干粉、细菌理化特性鉴定用的培养基和药敏试纸购自杭州天和微生物公司； 革兰氏染液购自南京建成生物工程研究所；PCR扩增试剂购自宝生物工程（大连）有限公司；PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离 在无菌条件下，用酒精棉球擦拭患病鳖体表后进行解剖，取血、心、肝、脾和肠等组织样品，分别在营养琼脂培养基平板（pH 7.4）上划线培养，28 ℃恒温培养12 h，根据菌落特征，挑取单菌落划线分离。

1.2.2 细菌形态观察 将分离菌接种于培养基平板上，置于 28 ℃培养12 h，取菌体涂片，革兰氏染色后用光学显微镜观察菌体形态和染色特征。

1.2.3 致病性试验 将分离菌接种于液体营养培养基中，置于28 ℃振荡培养6 h，取菌体涂片镜检，确认纯度后低速离心收集沉淀，加入灭菌生理盐水制成细菌悬液。取6只中华鳖分为试验组和对照组，每组 3只。试验组每只鳖肌肉注射0.5 mL 细菌悬液（浓度约为1×109 CFU/mL）；对照组每只注射0.5 mL生理盐水，分别隔离饲养，记录发病和死亡情况。

1.2.4 16S rDNA序列测定 16S rDNA基因序列的扩增采用细菌通用引物，正向引物为27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物1492R： 5′-TACGGTTACCTT GTTACGACTT-3′。扩增片段大小约1 470 bp。PCR扩增反应体系：10×Buffer 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL，10 μmol/L引物各1 μL，5 U/μL Taq酶 0.5 μL，模板菌液3 μL，ddH2O补足至50 μL。PCR扩增反应程序：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，并将阳性克隆送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行核苷酸序列测定。

1.2.5 药敏试验 药物敏感性试验按纸片扩散法[5]进行，测定抑菌圈直径，并参照NCCLS判断标准[6]进行敏感性判定。检测的抗生素包括青霉素G、头孢他啶、头孢西丁、复达欣、万古霉素、庆大霉素、链霉素、卡那霉素、妥布霉素、新霉素、阿米卡星、强力霉素、四环素、氯霉素、红霉素、复方新诺明、呋喃妥因、呋喃唑酮、诺氟沙星和环丙沙星等20种。

2 结果与分析

2.1 细菌的形态特征

从患病的中华鳖肺组织中分离到一种优势菌，标记为J。细菌J染色后呈红色，短杆状，两端钝圆，直形或弧形，单个或成对排列，初步判定为革兰氏阴性短杆菌（图1）。

2.2 细菌致病性试验

健康中华鳖接种细菌J的悬液。接种后12 d对照组正常，而感染组则出现死亡。对死亡鳖进行分菌培养，经染色、镜检为相同菌株。结果表明，分离菌J具有致病性，且感染中华鳖后出现典型性特征即肺肿大（图2）。

2.3 细菌16S rDNA序列鉴定

利用16S rDNA通用引物进行PCR扩增（图3），获得了菌株的核苷酸序列。将核苷酸测序结果通过BLAST比对，发现菌株J与GenBank上收录的嗜水气单胞菌同源性高达99%，根据细菌J的表型特征和生理生化特性，可以判定细菌J与嗜水气单胞菌为同一属的细菌。

2.4 药敏试验

选取常用的20种抗生素药敏纸片，对嗜水气单胞菌J进行药敏试验。结果（表1）表明，嗜水气单胞菌J对庆大霉素、头孢他啶、头孢西丁、链霉素、呋喃妥因敏感，对诺氟沙星、红霉素、阿米卡星、环丙沙星中敏，对其他11种抗生素有耐药性。

3 小结与讨论

本研究从采集到的中华鳖病样中分离到单一优势菌株，经革兰氏染色进行表型分析，结合目前正逐步广泛用于养殖环境微生物群落的分析和病原菌鉴定的16S rDNA通用引物PCR扩增法[7，8]，较快速、准确地判定该菌株为嗜水气单胞菌。通过细菌回感试验，发现该菌有致病性，且所引起的病症具有典型性即肺部肿大、发红。而药敏试验结果表明，这种菌有较强的耐药性。到目前为止，研究已经发现气单胞菌作为条件致病菌，能够产生肠毒素、坏死毒素、溶血素等细胞外毒素[9-11]，从而引发中华鳖多种疾病[12-17]。由于嗜水气单胞菌的变异菌株较多，每种之间对不同种的抗生素敏感性差异较大，因此必须针对性筛选高敏药物。本研究中分离到的菌株所引起的中华鳖肺组织肿大坏死症具有发病快、持续性死亡的特征，且死亡率达到70%左右，属于高致病菌株，对其研究有利于为诊断和治疗提供科学依据。

参考文献：

[1] 吴会民，林文辉，石存斌.嗜水气单胞菌研究概述[J].河北渔业， 2007（3）：7-11.

[2] 沈锦玉.嗜水气单胞菌的研究进展[J].浙江海洋学院学报（自然科学版），2008，27（1）：78-86.

[3] 文祝友，刘晓燕，金燮理.三角帆蚌嗜水气单胞菌病的病理研究[J].湖南农业大学学报，2001，27（1）：57-59.

[4] 林居纯，罗忠俊，舒 刚，等.嗜水气单胞菌临床分离菌对抗菌药物的耐药性调查[J].安徽农业科学，2009，37（15）：7024-7025.

[5] 沈 萍，范秀容，李广武.微生物学实验[M].第三版.北京：高等教育出版社，1999.62-64.

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[8] PAUNGFOO C，PRASERTSAN P，BURRELL P C，et al. Nitrifying bacterial communities in an aquaculture wastewater treatment system using fluorescence in situ hybridization（FISH），16S rRNA gene cloning，and phylogeneticanalysis[J]. Biotechn Bioeng，2007，97（4）：985-990.

[9] ROSSI O D， AMARAL L A， NADER A，et al. Enterotoxigenicity of Aeromonas sp strains isolated from differents points in the cattle slaughter ing processing line[J]. Arq Br as Med Vet Zoo ，2001， 53（5）：589-594.

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[11] SOPINSKA A， GROCHOLA A， GUZ L.Pathogenicity of Aeromonas sp. for carp and their cytotoxity[J]. Med Weter， 1997，53（7）：394-397.

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[13] 马有智，舒妙安.中华鳖温和气单胞菌病的病原研究[J].浙江大学学报（理学版），2000，27（3）：329-333.

[14] 陆宏达，金丽华.鳖嗜水气单胞菌败血症的研究[J].水产学报， 1996，20（3）：223-234.

[15] 崔青曼，袁春营，张跃红.中华鳖腐皮病病原菌及防治药物研究[J].水利渔业，1998（5）：13-14，351.

[16] 丁 雷，岳永生，宋憬愚.鳖白底板病腐皮病并发症病原菌及药物治疗[J].淡水渔业，2001，31（1）：46-48.

[17] 孙红祥，舒妙安.中华鳖几种常见疾病病原的分离鉴定及药敏试验[J].中国兽医学报，2002，22（2）：140-142.

（责任编辑 屠 晶）

3 小结与讨论

本研究从采集到的中华鳖病样中分离到单一优势菌株，经革兰氏染色进行表型分析，结合目前正逐步广泛用于养殖环境微生物群落的分析和病原菌鉴定的16S rDNA通用引物PCR扩增法[7，8]，较快速、准确地判定该菌株为嗜水气单胞菌。通过细菌回感试验，发现该菌有致病性，且所引起的病症具有典型性即肺部肿大、发红。而药敏试验结果表明，这种菌有较强的耐药性。到目前为止，研究已经发现气单胞菌作为条件致病菌，能够产生肠毒素、坏死毒素、溶血素等细胞外毒素[9-11]，从而引发中华鳖多种疾病[12-17]。由于嗜水气单胞菌的变异菌株较多，每种之间对不同种的抗生素敏感性差异较大，因此必须针对性筛选高敏药物。本研究中分离到的菌株所引起的中华鳖肺组织肿大坏死症具有发病快、持续性死亡的特征，且死亡率达到70%左右，属于高致病菌株，对其研究有利于为诊断和治疗提供科学依据。

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（责任编辑 屠 晶）

3 小结与讨论

本研究从采集到的中华鳖病样中分离到单一优势菌株，经革兰氏染色进行表型分析，结合目前正逐步广泛用于养殖环境微生物群落的分析和病原菌鉴定的16S rDNA通用引物PCR扩增法[7，8]，较快速、准确地判定该菌株为嗜水气单胞菌。通过细菌回感试验，发现该菌有致病性，且所引起的病症具有典型性即肺部肿大、发红。而药敏试验结果表明，这种菌有较强的耐药性。到目前为止，研究已经发现气单胞菌作为条件致病菌，能够产生肠毒素、坏死毒素、溶血素等细胞外毒素[9-11]，从而引发中华鳖多种疾病[12-17]。由于嗜水气单胞菌的变异菌株较多，每种之间对不同种的抗生素敏感性差异较大，因此必须针对性筛选高敏药物。本研究中分离到的菌株所引起的中华鳖肺组织肿大坏死症具有发病快、持续性死亡的特征，且死亡率达到70%左右，属于高致病菌株，对其研究有利于为诊断和治疗提供科学依据。

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（责任编辑 屠 晶）