猪圆环病毒2型SYBR GreenⅠ荧光定量PCR诊断方法的建立

2015-01-20余波周思旋谭诗文等

湖北农业科学 2014年22期

余波　周思旋　谭诗文　等

摘要：根据GenBank中猪圆环病毒2型ORF2基因序列设计特异性引物，PCR扩增获得猪圆环病毒2型ORF2基因片段，并克隆到pMD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR Green I荧光定量PCR反应条件的优化，建立了猪圆环病毒2型的SYBR Green I荧光定量PCR诊断方法。扩增产物的溶解曲线分析只出现1个单特异峰，无引物二聚体，对PRV、PPV、E.coli、CSFV、PRRSV均无阳性信号，可重复性好，测灵敏度可达4.0×101拷贝/μL。结果表明，建立的猪圆环病毒2型SYBR Green I 实时荧光定量PCR具有特异、灵敏、快速、重复性好，适合于猪圆环病毒2型临床样品的检测。

关键词：猪圆环病毒2型；ORF2基因；SYBR Green I荧光定量PCR

中图分类号：S854.4+3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）22-5474-04

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2， PCV-2）主要导致断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的发生，表现为免疫系统损伤，淋巴细胞减少、淋巴结肿大等病变，同时引起其他病原的继发感染，目前已成为严重阻碍养猪业发展的主要病原之一[1-3]。目前检测PCV-2主要有ELISA、胶体金、PCR等方法，但ELISA、胶体金主要用于检测PCV-2抗体，且操作复杂、耗时长[4，5]。普通PCR不能进行定量分析，且灵敏度相对较低，无法检测猪场的隐性感染。荧光定量PCR是与常规PCR比较，具有重复性好、灵敏度高、能够定量等优点，已经被广泛应用于多种疾病病原的检测[6，7]。本研究根据GenBank中猪圆环病毒2型ORF2基因序列设计特异性的引物，利用PCR技术扩增获得猪圆环病毒2型ORF2基因片段，并克隆到pMD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR Green I荧光定量PCR反应条件的优化，建立猪圆环病毒2型的SYBR Green I荧光定量PCR诊断方法，为猪圆环病毒2型临床样品的检测提供科学的诊断方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菌株：PCV-2、PRV闽-1株、PPV强毒株7909、CSFV、PRRSV、猪源大肠杆菌由贵州省畜禽疫病研究实验室保存。

主要试剂及仪器：Goldview、Tris、EDTA、Taq DNA Polymerase（5U/μL）及相应10×Taq Buffer、dNTP、DH5α，pMD-18T、SYBR Green I荧光定量PCR酶等购自宝生物（大连）工程有限公司；TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技有限公司。荧光定量PCR仪为Eppendorf Mastercycler ep realplex 4实时荧光定量PCR仪。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计根据ORF2 GenBank中猪圆环病毒2型ORF2基因序列设计1对特异性引物，上游引物：5′-GGAAGACCAATGTACACGTCATT-3′，下游引物：5′-GGTGGTTTCCAGTATGTGGTTTC-3′，引物由宝生物（大连）工程有限公司合成。

1.2.2 病毒核酸的提取

1）组织样品：取待检样品淋巴结组织样品共约0.5 g，加入500 μL PBS缓冲液，待检样品研磨后-70 ℃反复冻融3次，12 000 r/min离心取上清液用于核酸的提取。病毒DNA/RNA的提取参照TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书进行，将提取的DNA/RNA于-70 ℃保存。猪大肠杆菌参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行，将提取的DNA-20 ℃保存。

2）血清样品：取50 μL血清加入等体积的血清裂解缓冲液（50 μmol/L Tris-HCl（pH 8.0），150 μmol/L NaCl，2 μmol/L EDTA，1%Triton×100，5%SDS），混匀后煮沸5 min，12 000 r/min离心取上清液2 μL用于荧光定量PCR和普通PCR。

1.2.3 pMD-18T-PCV2-ORF2阳性标准品的制备

用“1.2.1”中的引物，对PCV-2进行PCR扩增，反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环； 72 ℃ 10 min。将扩增的目的片段与pMD-18-克隆载体连接，转化感受态细胞DH5α，重组体命名为pMD-18T-PCV2-ORF2，同时送宝生物工程（大连）有限公司测序。用紫外分光光度计测定测序正确的重组质粒pMD-18T-PCV2-ORF2在D260 nm/D280 nm处的吸光度，得到重组质粒的浓度和纯度，进行10倍梯度倍比稀释，作为阳性标准品。

1.2.4 荧光定量PCR反应条件的优化荧光定量PCR反应在25 μL反应体系中进行，对荧光定量PCR反应条件，包括退火温度（50、55、60 ℃）、引物浓度（5、10、20 μmol/L）进行优化以确定最佳反应条件。上下游引物（5、10、20 μmol/L）各1 μL，Premix Ex Taq 12.5 μL，ROX Reference Dye 0.5 μL，模板1 μL，用超纯水补足至25 μL，同时以去离子水作为空白对照。反应条件为：94 ℃ 10 s；94 ℃ 5 s、退火温度（50、55、60 ℃）10 s、72 ℃10 s，40个循环。

1.2.5 荧光定量PCR反应标准曲线的建立用紫外分光光度计测定测序正确的重组质粒pMD-18T-PCV2-ORF2，计算出重组质粒的浓度和纯度，计算DNA拷贝数，随后将标准阳性样本进行连续10倍系列稀释，以“1.2.4”的条件进行扩增，每个稀释倍数3个重复，以拷贝数为横坐标，以Ct值为纵坐标建立标准曲线。

1.2.6 敏感性试验将重组质粒pMD-18T-PCV2-ORF2计算DNA拷贝数后，进行10倍比稀释后分别进行荧光定量PCR反应，每个稀释倍数3个重复，以确定建立的荧光定量PCR诊断的敏感性。

1.2.7 特异性试验以PCV-2、PPV、PRV、E.coli DNA、CSFV、PRRSV cDNA进行荧光定量PCR反应，每个样品3个重复，以确定建立的荧光定量PCR诊断方法的特异性。

1.2.8 重复性试验应用建立的荧光定量PCR方法重复检测PCV-2 DNA样品3次，以检验结果的可靠性。

1.2.9 荧光定量PCR方法对临床样品的检测对2012～2013年贵州省贵阳市、黔西南、遵义、黔南州、铜仁地区几个生猪养殖场和养殖专业户采集的75份疑似病料（组织），194头份发病猪场未发病猪血清，应用建立的荧光定量PCR检测方法进行检测，同时应用文献[8]中的方法进行普通PCR检测。

2 结果与分析

2.1 pMD-18T-PCV2-ORF2阳性标准品的制备

用“1.2.1”中的引物，对PCV-2进行PCR扩增，能有效扩增出目的片段，片段大小为105 bp，无非特异性片段产生（图1）。将宝生物（大连）工程有限公司测序结果与GenBank中的PCV-2 ORF2基因序列比对，核苷酸相似度为98.9%～100%。

2.2 荧光定量PCR反应条件的优化

荧光定量PCR反应在25 μL反应体系中最佳反应条件为：退火温度55 ℃，引物浓度10 μmol/L，能出现最高的荧光值、最小的Ct值，且在溶解曲线分析中不出现非特异性峰。

2.3 荧光定量PCR反应标准曲线的建立

将标准样品10倍倍比稀释，取4.0×107、4.0×106、4.0×105、4.0×104、4.0×103、4.0×102、4.0×101拷贝/μL 7种不同浓度重组质粒作为模板进行荧光定量PCR扩增反应，得到扩增反应的标准曲线（图2），线性回归方程为Ct=-2.894×lgcopies+32.89（R2=0.994）。

2.4 溶解曲线分析

在SYBR Green I荧光定量PCR结束后对扩增反应溶解曲线分析，结果见图3。由图3可见，扩增产物的溶解温度Tm为84.0～84.4 ℃，没有引物二聚体和非特异性产物等其他峰值出现。

2.5 敏感性试验

将标准样品倍比稀释，取4.0×107、4.0×106、4.0×105、4.0×104、4.0×103、4.0×102、4.0×101、4.0×100拷贝/μL 8种不同浓度重组质粒作为模板进行荧光定量PCR扩增。由图4可见，结果显示其灵敏度为4.0×101拷贝/μL。

2.6 特异性试验

由图5可见，以PCV-2、PPV、PRV、E.coli DNA、CSFV、PRRSV cDNA进行荧光定量PCR反应，以确定建立的荧光定量PCR诊断方法的特异性。结果PCV-2为阳性，而PPV、PRV、E.coli DNA、CSFV、PRRSV cDNA为阴性。

2.7 重复性试验

应用建立的荧光定量PCR方法重复检测PCV-2 DNA样品3次，以检验结果的可靠性，结果均一致。

2.8 荧光定量PCR对临床样品的检测

对2012～2013年贵州省贵阳市、黔西南、遵义、黔南州、铜仁地区几个生猪养殖场和养殖专业户75份疑似病料（组织）荧光定量PCR阳性率为29.3%（22/75），普通PCR阳性率为29.3%（22/75）。194头份发病猪场未发病猪血清荧光定量PCR阳性率为9.2%（18/194），普通PCR阳性率为0%（0/194）。

3 小结与讨论

目前利用PCR技术或者是血清学方法对猪场中的PCV-2感染情况进行检测是控制PMWS的有效方法[9]。普通PCR在PCV-2的净化中发挥了重要作用，但普通PCR检测的灵敏度相对较低，主要用于组织病料的检测，不能有效检出猪群血清中PCV-2的隐形感染。陈蓉等[10]建立基于TaqMan探针的猪圆环病毒2型荧光定量PCR检测方法，该方法的敏感性为6×101拷贝/μL，比普通PCR高2个数量级，对临床样本的阳性检出率（64%）明显高于普通PCR（44%）。曾思遥等[11]以猪圆环病毒2型核衣壳蛋白ORF2基因，设计合成特异性引物和探针，建立了PCV-2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，可达100拷贝/μL，可有效检测出淋巴结、肺脏等组织中的PCV-2，但其未对感染猪场未发病猪血清进行检测。

基于SYBR GreenⅠ的实时荧光定量PCR技术则无需探针，且价格较TaqMan探针低廉，虽然引物二聚体及非特异性扩增可能影响检测结果的特异性，但可以通过融解曲线分析克服这一缺陷[12]。本研究根据猪圆环病毒2型ORF2基因序列设计特异性的引物，利用PCR技术扩增获得猪圆环病毒2型ORF2基因片段，并克隆到pMD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR Green I荧光定量PCR反应条件的优化，建立了猪圆环病毒2型的SYBR Green I荧光定量PCR诊断方法，灵敏度可达4.0×101拷贝/μL，扩增产物的溶解温度Tm为84.0～84.4℃，没有引物二聚体和非特异性产物等其他峰值出现，适合于PCV-2临床样品的检测。

本研究中75份疑似病死猪病料（组织）中病毒含量量较高，因此荧光定量PCR和普通PCR符合率为100%，而发病猪场未发病猪血清PRV病毒含量较低，普通PCR未检测到血清中的病毒，而建立的实时荧光定量PCR能检测到PCV-2 DNA。且本研究建立的血清中病毒提取方法，能够快速的提取病毒DNA。因此，本研究建立的PCV-2 SYBR Green I 实时荧光定量PCR可应用于PCV-2早期感染和隐性感染检测，有利于猪场PCV-2的净化。

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（责任编辑程碧军）