禽肉瘤白血病病毒重组载体的包装及病毒滴度的测定

龚萍　杨宇　杨永平　等

摘要：将重组逆转录病毒融合蛋白表达载体RCASBP-GFP-SMARCE1包装为病毒颗粒，并测定其病毒滴度。利用脂质体转染法在DF-1细胞系中转染重组质粒，收集上清液，超速离心浓缩病毒，用GFP标记法测定病毒滴度。结果显示，转染后3～4 d可见少许GFP阳性细胞的出现，6～7 d后所有细胞均有GFP的表达，11 d左右细胞达到超汇合状态，开始收集上清液；GFP标记法测定超速离心后的病毒滴度为5×1010 IU/mL。结果表明，成功制备了高滴度的重组逆转录病毒颗粒，为下一步在胚胎中进行相关基因的功能研究奠定了基础。

关键词：逆转录病毒载体；病毒包装；绿色荧光蛋白；病毒滴度

中图分类号：S852.65+9.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）22-5470-04

逆转录病毒载体介导的基因转移技术已被广泛应用于基因治疗和基因功能的研究。逆转录病毒是一类含有逆转录酶的 RNA 病毒，分为慢病毒亚科（如人类免疫缺陷病毒）、肿瘤病毒亚科（如禽类劳氏肉瘤病毒）和泡沫病毒亚科（如人泡沫病毒）三类[1]。逆转录病毒具有3个基本的结构基因Gag、Env和pol，分别编码病毒的核心蛋白、病毒的包膜糖蛋白和逆转录酶。逆转录病毒经寄主细胞表面的受体蛋白识别后进入细胞，然后在自身基因组编码的逆转录酶的作用下，以基因组RNA 为模板反转录出双链DNA原病毒，双链DNA能随机整合到寄主细胞的染色体上，随着寄主细胞的复制而复制[2]。逆转录病毒载体大多基于禽类或兽类病毒，逆转录病毒的许多特点使其成为基因转移载体的最佳选择，如宿主细胞范围广，对细胞的感染率高，插入的外源基因可完整地整合等。目前在禽类中应用的逆转录病毒载体主要来源于禽类白血病病毒（Avian leucosis virus，ALV）、禽类劳氏肉瘤病毒（Rous sarcoma virus，RSV）以及慢病毒（Lentivirus）等[3，4]。其中慢病毒与一般的逆转录病毒相比，具有更广的宿主范围，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，但慢病毒表达的时间较慢，且慢病毒是“自杀性”病毒，即病毒感染靶细胞后，不再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。而以禽肉瘤白血病病毒（Avian sarcoma leucosis virus，ASLV）为骨架的逆转录病毒RCASBP（Replication-competent avian sarcoma-leukosis virus，with a splice acceptor，bryan RSV pol）是一种具有自我复制能力的病毒，既能水平感染相邻细胞，也能垂直感染后代细胞[5]，近年来在鸡胚发育相关基因的功能研究中得到广泛应用[6-8]。本研究拟将本课题组前期构建的重组逆转录病毒融合蛋白表达载体在DF-1细胞系中包装病毒颗粒并测定病毒滴度，以期获得高滴度的逆转录病毒，为进一步在细胞模型和鸡胚模型中研究相关基因的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 质粒与细胞 逆转录病毒载体RCASBP.B由美国Cliff Tabin教授（Harvard Medical School）惠赠、重组载体RCASBP.B-GFP-SMARCE1（简称RGS）由本实验室构建并保存、鸡胚成纤维细胞系UMNSAH/DF-1购自美国ATCC（CRL-12203）。

1.1.2 主要试剂 无内毒素质粒提取试剂盒购自Omiga公司；Lipofectemine 2000、Opti-MEMⅠ低血清培养基购自Invitrogen公司；无噬菌体、低内毒素的胎牛血清购自Gibco公司；DMEM培养基购自ATCC；青霉素/链霉素双抗、0.25%胰蛋白酶购自杭州吉诺公司。

1.2 方法

1.2.1 DF-1细胞的解冻与传代 从干冰中迅速取出购买的鸡胚成纤维细胞系DF-1冻存管，立即在39 ℃水浴锅中解冻（最好在2 min内完成）；在超净工作台内将管内液体转至含有9 mL预热生长培养基（含有10.0%胎牛血清和1.0%双抗的DMEM）的尖头离心管中，1 000 r/min离心5 min；弃上清液，用10 mL预热生长培养基重悬细胞，转至培养瓶中，在39 ℃、5.0%CO2培养箱中培养；在不同时间观察细胞生长情况，待细胞长满后，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，按1∶3的比例分瓶培养。

1.2.2 脂质体转染与病毒包装 在转染前1 d胰酶消化法将DF-1细胞接种到10 cm培养皿中，待细胞80.0%-90.0%汇合时将20 μg无内毒素质粒与40 μL Lipofectamine 2 000分别用Opti-MEMⅠ培养基稀释后混合，转染DF-1细胞，加入含10.0%胎牛血清的DMEM培养基培养，24 h后换为生长培养基，待细胞长满后传代至15 cm培养皿中；期间观察细胞生长及绿色荧光蛋白表达情况，最后将细胞传至6个15 cm培养皿中；待细胞汇合后36～48 h换用1/10的生长培养基（含有1.0%胎牛血清和0.1%双抗的DMEM）；换液24 h后收集上清液于50 mL离心管中，离心管于液氮中保存，细胞中继续加入1/10的生长培养基，如此重复，连续收集病毒上清液3 d。

1.2.3 病毒的浓缩 将上述收集病毒上清液的离心管于37 ℃水浴锅中迅速解冻后置于冰上，在超净工作台内用0.45 μm的滤器过滤去除细胞碎片；转移上清液至超速离心管中， 4 ℃下27 000 r/min超速离心3 h；弃上清液，加入100～300 μL DMEM原液，将离心管置于冰上振荡重悬过夜；待病毒沉淀完全溶解后吹打均匀，分装，-80 ℃保存。

1.2.4 病毒滴度的测定 将DF-1细胞接种于24孔板中，第二天用DMEM原液按10倍梯度稀释病毒液，即在EP管中先加入90 μL DMEM，往第一个管中加入10 μL病毒原液，混匀后，吸取10 μL加入第二个管混匀，依此类推，梯度稀释至10-8；每孔细胞加入100 μL稀释的病毒液，每个梯度设置3个重复，并设置阴性对照组（即不加病毒液）；在不同时间观察细胞生长情况，并追加生长培养基，利于细胞的生长；48 h后观察各孔中GFP的表达，计算病毒滴度（IU/mL）[6]。

2 结果与分析

2.1 DF-1细胞的培养

DF-1细胞系解冻复苏后传代，待细胞生长稳定后再进行转染。在显微镜下观察发现，解冻的细胞从圆形慢慢伸展开来变成纤维状，如图1所示，解冻后12 h有部分细胞已伸展开来，此时的死细胞较多，随着细胞的增殖，到解冻后36 h细胞已长满；传代后的细胞生长良好，具有典型的成纤维细胞形态，传代后24 h即铺满瓶底，可用于传代。

2.2 病毒的包装

在转染后不同时间观察细胞的生长状态及绿色荧光蛋白的表达，结果显示，转染后细胞生长良好，转染后2～4 d可见少许GFP阳性细胞的出现，之后GFP阳性细胞数量越来越多，荧光的亮度越来越强；转染后7～8 d所有的细胞都有绿色荧光蛋白的表达；转染后11 d左右，15 cm培养皿中的细胞已达到超汇合状态，此时收集上清液即含有较多病毒颗粒；在高倍镜下观察细胞质和细胞核中均有较强荧光信号（图2）。

2.3 逆转录病毒滴度的测定

将浓缩的病毒液，从10-3到10-8逐级稀释后感染DF-1细胞，48 h后观察GFP阳性细胞的数量，如图3所示，10-3中大部分细胞为GFP阳性细胞，之后逐级减少，到10-8时仅有少数细胞有绿色荧光信号，计算病毒滴度为5×1010 IU/mL，达到病毒滴度≥108 IU/mL的要求。

3 讨论

病毒滴度即每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。病毒滴度的测定是病毒载体应用过程中十分重要的步骤，为保证病毒具有较高的感染效率，须达到一定的滴度，如本研究所用的RCASBP病毒的滴度应至少达到108 IU/mL，才能在禽类胚胎中迅速感染[9]。目前测定病毒滴度的方法有很多种，如细胞病变法、空斑法、OD260 nm法、壳蛋白免疫法、荧光定量PCR法和GFP标记法等[10-12]。其中细胞病变法和空斑法是最传统的方法，操作耗时且稳定性不好；OD260 nm法是测定病毒颗粒在260 nm处的吸光度，耗时短、成本低且稳定，但不能区分感染性和缺陷性病毒颗粒，故应用价值有限[11]；壳蛋白免疫法是最为标准、结果最为可靠的方法，但其对试剂的要求及成本较高；荧光定量PCR法是对病毒液中的完整病毒颗粒数进行精确的定量[13]，操作简单、成本适中，但结果并不十分可靠，因为并非所有完整的病毒颗粒均具有感染力；GFP标记法是直接在显微镜下观察GFP阳性细胞的数量，操作简单、成本低、耗时短、稳定性好，但只适用于带有GFP标签的病毒载体。孙鹏宇等[11]比较了上述几种不同的测定方法，发现GFP标记法与传统的细胞病变法及标准的壳蛋白免疫法的测定结果差异不显著。因此，在测定带有GFP标签的病毒滴度时，GFP标记法是最为快速、有效且成本低廉的方法；不带GFP标签的病毒载体在不影响其他功能的情况下，最好能引入GFP标签，可为后续试验带来便利。如本研究在构建靶基因的重组逆转录病毒载体时，引入GFP标签构建成融合蛋白表达载体，测定病毒滴度时即采用GFP标记法进行；另外，引入的GFP标签也可为后续细胞模型和胚胎模型中的研究带来直观的结果。

本研究成功制备了高滴度的RCASBP-GFP-SMARCE1逆转录病毒颗粒，为下一步在胚胎中进行相关基因的功能研究奠定了基础。

参考文献：

[1] ISHII Y， REESE D E， MIKAWA T. Somatic transgenesis using retroviral vectors in the chicken embryo[J]. Dev Dyn， 2004， 229（3）： 630-642.

[2] ISHII Y， MIKAWA T. Somatic transgenesis in the avian model system[J]. Birth Defects Res C Embryo Today， 2005， 75（1）： 19-27.

[3] SMITH C A， ROESZLER K N， SINCLAIR A H. Robust and ubiquitous GFP expression in a single generation of chicken embryos using the avian retroviral vector， RCASBP[J]. Differentiation， 2009， 77（5）：473-482.

[4] VON W A， SEIDLER B， SCHMID R M， et al. Production of avian retroviruses and tissue-specific somatic retroviral gene transfer in vivo using the RCAS/TVA system[J]. Nat Protoc， 2012， 7（6）： 1167-1183.

[5] GORDON C T， RODDA F A， FARLIE P G. The RCAS retroviral expression system in the study of skeletal development[J]. Dev Dyn，2009，238（4）：797-811.

[6] SMITH C A， ROESZLER K N， OHNESORG T， et al. The avian Z-linked gene DMRT1 is required for male sex determination in the chicken[J]. Nature， 2009， 461（7261）： 267-271.

[7] GONG P， YANG Y P， YANG Y， et al. Different gene transfer methods at the very early， early， late and whole embryonic stages in chicken[J]. Acta Biol Hung， 2012， 63（4）： 453-462.

[8] LAMBETH L S， CUMMINS D M， DORAN T J， et al. Overexpression of aromatase alone is sufficient for ovarian development in genetically male chicken embryos[J]. PLoS One， 2013， 8（6）： e68362.

[9] LOGAN M， TABIN C. Targeted gene misexpression in chick limb buds using avian replication-competent retroviruses[J]. Methods， 1998， 14（4）： 407-420.

[10] THOMAS MA， LICHTENSTEIN DL， KRAJCSI P， et al. A real-time PCR method to rapidly titer adenovirus stocks[J]. Methods Mol Med， 2007， 130： 185-192.

[11] 孙鹏宇，张艳玲，荆玉明，等.腺病毒滴度不同测定方法比较[J].南方医科大学学报，2011，31（2）：234-238.

[12] 钟艳平，林若芸，黎丹戎，等.HTERT重组第三代慢病毒载体的构建及其病毒包装鉴定[J].中国生物工程杂志，2011，31（9）：21-27.

[13] MAGALDI T G， BUCH M H， MURATA H， et al. Mutations in the GM1 binding site of simian virus 40 VP1 alter receptor usage and cell tropism[J]. J Virol， 2012， 86（13）： 7028-7042.

（责任编辑 程碧军）

2 结果与分析

2.1 DF-1细胞的培养

DF-1细胞系解冻复苏后传代，待细胞生长稳定后再进行转染。在显微镜下观察发现，解冻的细胞从圆形慢慢伸展开来变成纤维状，如图1所示，解冻后12 h有部分细胞已伸展开来，此时的死细胞较多，随着细胞的增殖，到解冻后36 h细胞已长满；传代后的细胞生长良好，具有典型的成纤维细胞形态，传代后24 h即铺满瓶底，可用于传代。

2.2 病毒的包装

在转染后不同时间观察细胞的生长状态及绿色荧光蛋白的表达，结果显示，转染后细胞生长良好，转染后2～4 d可见少许GFP阳性细胞的出现，之后GFP阳性细胞数量越来越多，荧光的亮度越来越强；转染后7～8 d所有的细胞都有绿色荧光蛋白的表达；转染后11 d左右，15 cm培养皿中的细胞已达到超汇合状态，此时收集上清液即含有较多病毒颗粒；在高倍镜下观察细胞质和细胞核中均有较强荧光信号（图2）。

2.3 逆转录病毒滴度的测定

将浓缩的病毒液，从10-3到10-8逐级稀释后感染DF-1细胞，48 h后观察GFP阳性细胞的数量，如图3所示，10-3中大部分细胞为GFP阳性细胞，之后逐级减少，到10-8时仅有少数细胞有绿色荧光信号，计算病毒滴度为5×1010 IU/mL，达到病毒滴度≥108 IU/mL的要求。

3 讨论

病毒滴度即每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。病毒滴度的测定是病毒载体应用过程中十分重要的步骤，为保证病毒具有较高的感染效率，须达到一定的滴度，如本研究所用的RCASBP病毒的滴度应至少达到108 IU/mL，才能在禽类胚胎中迅速感染[9]。目前测定病毒滴度的方法有很多种，如细胞病变法、空斑法、OD260 nm法、壳蛋白免疫法、荧光定量PCR法和GFP标记法等[10-12]。其中细胞病变法和空斑法是最传统的方法，操作耗时且稳定性不好；OD260 nm法是测定病毒颗粒在260 nm处的吸光度，耗时短、成本低且稳定，但不能区分感染性和缺陷性病毒颗粒，故应用价值有限[11]；壳蛋白免疫法是最为标准、结果最为可靠的方法，但其对试剂的要求及成本较高；荧光定量PCR法是对病毒液中的完整病毒颗粒数进行精确的定量[13]，操作简单、成本适中，但结果并不十分可靠，因为并非所有完整的病毒颗粒均具有感染力；GFP标记法是直接在显微镜下观察GFP阳性细胞的数量，操作简单、成本低、耗时短、稳定性好，但只适用于带有GFP标签的病毒载体。孙鹏宇等[11]比较了上述几种不同的测定方法，发现GFP标记法与传统的细胞病变法及标准的壳蛋白免疫法的测定结果差异不显著。因此，在测定带有GFP标签的病毒滴度时，GFP标记法是最为快速、有效且成本低廉的方法；不带GFP标签的病毒载体在不影响其他功能的情况下，最好能引入GFP标签，可为后续试验带来便利。如本研究在构建靶基因的重组逆转录病毒载体时，引入GFP标签构建成融合蛋白表达载体，测定病毒滴度时即采用GFP标记法进行；另外，引入的GFP标签也可为后续细胞模型和胚胎模型中的研究带来直观的结果。

本研究成功制备了高滴度的RCASBP-GFP-SMARCE1逆转录病毒颗粒，为下一步在胚胎中进行相关基因的功能研究奠定了基础。

参考文献：

[1] ISHII Y， REESE D E， MIKAWA T. Somatic transgenesis using retroviral vectors in the chicken embryo[J]. Dev Dyn， 2004， 229（3）： 630-642.

[2] ISHII Y， MIKAWA T. Somatic transgenesis in the avian model system[J]. Birth Defects Res C Embryo Today， 2005， 75（1）： 19-27.

[3] SMITH C A， ROESZLER K N， SINCLAIR A H. Robust and ubiquitous GFP expression in a single generation of chicken embryos using the avian retroviral vector， RCASBP[J]. Differentiation， 2009， 77（5）：473-482.

[4] VON W A， SEIDLER B， SCHMID R M， et al. Production of avian retroviruses and tissue-specific somatic retroviral gene transfer in vivo using the RCAS/TVA system[J]. Nat Protoc， 2012， 7（6）： 1167-1183.

[5] GORDON C T， RODDA F A， FARLIE P G. The RCAS retroviral expression system in the study of skeletal development[J]. Dev Dyn，2009，238（4）：797-811.

[6] SMITH C A， ROESZLER K N， OHNESORG T， et al. The avian Z-linked gene DMRT1 is required for male sex determination in the chicken[J]. Nature， 2009， 461（7261）： 267-271.

[7] GONG P， YANG Y P， YANG Y， et al. Different gene transfer methods at the very early， early， late and whole embryonic stages in chicken[J]. Acta Biol Hung， 2012， 63（4）： 453-462.

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[9] LOGAN M， TABIN C. Targeted gene misexpression in chick limb buds using avian replication-competent retroviruses[J]. Methods， 1998， 14（4）： 407-420.

[10] THOMAS MA， LICHTENSTEIN DL， KRAJCSI P， et al. A real-time PCR method to rapidly titer adenovirus stocks[J]. Methods Mol Med， 2007， 130： 185-192.

[11] 孙鹏宇，张艳玲，荆玉明，等.腺病毒滴度不同测定方法比较[J].南方医科大学学报，2011，31（2）：234-238.

[12] 钟艳平，林若芸，黎丹戎，等.HTERT重组第三代慢病毒载体的构建及其病毒包装鉴定[J].中国生物工程杂志，2011，31（9）：21-27.

[13] MAGALDI T G， BUCH M H， MURATA H， et al. Mutations in the GM1 binding site of simian virus 40 VP1 alter receptor usage and cell tropism[J]. J Virol， 2012， 86（13）： 7028-7042.

（责任编辑 程碧军）

2 结果与分析

2.1 DF-1细胞的培养

DF-1细胞系解冻复苏后传代，待细胞生长稳定后再进行转染。在显微镜下观察发现，解冻的细胞从圆形慢慢伸展开来变成纤维状，如图1所示，解冻后12 h有部分细胞已伸展开来，此时的死细胞较多，随着细胞的增殖，到解冻后36 h细胞已长满；传代后的细胞生长良好，具有典型的成纤维细胞形态，传代后24 h即铺满瓶底，可用于传代。

2.2 病毒的包装

在转染后不同时间观察细胞的生长状态及绿色荧光蛋白的表达，结果显示，转染后细胞生长良好，转染后2～4 d可见少许GFP阳性细胞的出现，之后GFP阳性细胞数量越来越多，荧光的亮度越来越强；转染后7～8 d所有的细胞都有绿色荧光蛋白的表达；转染后11 d左右，15 cm培养皿中的细胞已达到超汇合状态，此时收集上清液即含有较多病毒颗粒；在高倍镜下观察细胞质和细胞核中均有较强荧光信号（图2）。

2.3 逆转录病毒滴度的测定

将浓缩的病毒液，从10-3到10-8逐级稀释后感染DF-1细胞，48 h后观察GFP阳性细胞的数量，如图3所示，10-3中大部分细胞为GFP阳性细胞，之后逐级减少，到10-8时仅有少数细胞有绿色荧光信号，计算病毒滴度为5×1010 IU/mL，达到病毒滴度≥108 IU/mL的要求。

3 讨论

病毒滴度即每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。病毒滴度的测定是病毒载体应用过程中十分重要的步骤，为保证病毒具有较高的感染效率，须达到一定的滴度，如本研究所用的RCASBP病毒的滴度应至少达到108 IU/mL，才能在禽类胚胎中迅速感染[9]。目前测定病毒滴度的方法有很多种，如细胞病变法、空斑法、OD260 nm法、壳蛋白免疫法、荧光定量PCR法和GFP标记法等[10-12]。其中细胞病变法和空斑法是最传统的方法，操作耗时且稳定性不好；OD260 nm法是测定病毒颗粒在260 nm处的吸光度，耗时短、成本低且稳定，但不能区分感染性和缺陷性病毒颗粒，故应用价值有限[11]；壳蛋白免疫法是最为标准、结果最为可靠的方法，但其对试剂的要求及成本较高；荧光定量PCR法是对病毒液中的完整病毒颗粒数进行精确的定量[13]，操作简单、成本适中，但结果并不十分可靠，因为并非所有完整的病毒颗粒均具有感染力；GFP标记法是直接在显微镜下观察GFP阳性细胞的数量，操作简单、成本低、耗时短、稳定性好，但只适用于带有GFP标签的病毒载体。孙鹏宇等[11]比较了上述几种不同的测定方法，发现GFP标记法与传统的细胞病变法及标准的壳蛋白免疫法的测定结果差异不显著。因此，在测定带有GFP标签的病毒滴度时，GFP标记法是最为快速、有效且成本低廉的方法；不带GFP标签的病毒载体在不影响其他功能的情况下，最好能引入GFP标签，可为后续试验带来便利。如本研究在构建靶基因的重组逆转录病毒载体时，引入GFP标签构建成融合蛋白表达载体，测定病毒滴度时即采用GFP标记法进行；另外，引入的GFP标签也可为后续细胞模型和胚胎模型中的研究带来直观的结果。

本研究成功制备了高滴度的RCASBP-GFP-SMARCE1逆转录病毒颗粒，为下一步在胚胎中进行相关基因的功能研究奠定了基础。

参考文献：

[1] ISHII Y， REESE D E， MIKAWA T. Somatic transgenesis using retroviral vectors in the chicken embryo[J]. Dev Dyn， 2004， 229（3）： 630-642.

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[3] SMITH C A， ROESZLER K N， SINCLAIR A H. Robust and ubiquitous GFP expression in a single generation of chicken embryos using the avian retroviral vector， RCASBP[J]. Differentiation， 2009， 77（5）：473-482.

[4] VON W A， SEIDLER B， SCHMID R M， et al. Production of avian retroviruses and tissue-specific somatic retroviral gene transfer in vivo using the RCAS/TVA system[J]. Nat Protoc， 2012， 7（6）： 1167-1183.

[5] GORDON C T， RODDA F A， FARLIE P G. The RCAS retroviral expression system in the study of skeletal development[J]. Dev Dyn，2009，238（4）：797-811.

[6] SMITH C A， ROESZLER K N， OHNESORG T， et al. The avian Z-linked gene DMRT1 is required for male sex determination in the chicken[J]. Nature， 2009， 461（7261）： 267-271.

[7] GONG P， YANG Y P， YANG Y， et al. Different gene transfer methods at the very early， early， late and whole embryonic stages in chicken[J]. Acta Biol Hung， 2012， 63（4）： 453-462.

[8] LAMBETH L S， CUMMINS D M， DORAN T J， et al. Overexpression of aromatase alone is sufficient for ovarian development in genetically male chicken embryos[J]. PLoS One， 2013， 8（6）： e68362.

[9] LOGAN M， TABIN C. Targeted gene misexpression in chick limb buds using avian replication-competent retroviruses[J]. Methods， 1998， 14（4）： 407-420.

[10] THOMAS MA， LICHTENSTEIN DL， KRAJCSI P， et al. A real-time PCR method to rapidly titer adenovirus stocks[J]. Methods Mol Med， 2007， 130： 185-192.

[11] 孙鹏宇，张艳玲，荆玉明，等.腺病毒滴度不同测定方法比较[J].南方医科大学学报，2011，31（2）：234-238.

[12] 钟艳平，林若芸，黎丹戎，等.HTERT重组第三代慢病毒载体的构建及其病毒包装鉴定[J].中国生物工程杂志，2011，31（9）：21-27.

[13] MAGALDI T G， BUCH M H， MURATA H， et al. Mutations in the GM1 binding site of simian virus 40 VP1 alter receptor usage and cell tropism[J]. J Virol， 2012， 86（13）： 7028-7042.

（责任编辑 程碧军）