全反式维甲酸对腹膜透析相关性腹膜纤维化大鼠转化生长因子β1、结缔组织生长因子、α 平滑肌肌动蛋白表达的影响

李敏芝 熊燕移 史伟文 张莞灵 卓华钦

广东省东莞市第三人民医院肾内科，广东东莞 523320

腹膜透析（peritoneal dialysis）是一种以人体腹膜为透析膜的透析方案， 操作时需将透析液灌注至腹腔， 并通过腹膜另一侧的毛细血管网交换溶质和水分，最终清除患者体内潴留的代谢产物，同时补充机体所缺乏的相关物质[1]。腹膜透析技术具有操作简便、血流动力学影响小、 残余肾脏功能保护好等优势，但也存在腹膜纤维化等相关并发症。腹膜纤维化是腹膜透析主要并发症之一，也是多数腹膜透析患者退出腹膜透析的主要原因[2]。 全反式维甲酸（all trans retinoic acid，ATRA） 是动物体内维生素A 代谢的中间产物，具有广泛的生理学及药理学效用，为分析该药物在腹膜透析中的抗腹膜纤维化中的作用，本研究选取雄性SD 大鼠进行研究，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择40 只雄性SD 大鼠，周龄6～8 周，体重220～260 g，由山东大学动物实验研究中心提供，动物合格证号：SCKX20140017； 所有大鼠均喂养于室温24℃、安静、光照12 h、湿度45%、自由进食进水的环境中，编号后随机分为对照组、模型组、实验1 组、实验2组，每组各10 只。

1.2 药品与试剂

选用庆华邦制药有限公司生产的ATRA；选用美国Baxter 医疗用品有限公司生产的4.25%腹膜透析液； 选用武汉博士德生物工程有限公司生产的兔抗大鼠转化生长因子-β1（TGF-β1）、结缔组织生长因子（CTGF）以及α 平滑肌肌动蛋白（α-SMA）多克隆抗体；选用美国Sigma 公司生产的二甲亚砜；选用福州迈新生物技术开发有限公司生产的浓缩型DAB 显色剂；选用立陶宛MBI 公司生产的逆转录试剂盒；选用京博大泰克生物基因技术有限公司生产的PCR反应缓冲液。

1.3 方法

1.3.1 造模方法 对照组：腹腔注射生理盐水10 mL/d+5 mL 磷酸盐缓冲液稀释的二甲亚砜；模型组：腹腔注射4.25%腹透液10 mL/d+5 mL 磷酸盐缓冲液稀释的二甲亚砜；实验1 组：腹腔注射4.25%腹透液10 mL/d+ATRA 2 mg/kg；实验2 组：腹腔注射4.25%腹透液10 mL/d+ATRA 5 mg/kg。 所有大鼠均药物干预4 周，期间自由进食、饮水。

1.3.2 检测指标 干预4 周后处死大鼠，处死前1 h 对大鼠进行腹膜平衡实验。 局部麻醉后，向所有大鼠腹腔注入腹透液20 mL，30 min 后打开腹腔，吸取液体，称重，计算超滤量。同时给予大鼠股动脉取血操作，血标本置于-5℃温箱内待用。

避开注射部位取大鼠腹膜及肠系膜组织，一部分标本4%多聚甲醛固定， 一部分置于含1.5 mL Trizol的EP 管内。 选用荷兰威图Seleetra 全自动生化仪检测血液样本中的尿素、葡萄糖浓度及肝细胞生长因子（HGF）、骨形态发生蛋白-7（BMP-7）、白细胞介素-6（IL-6）、血管内皮生长因子（VEGF）表达水平。将多聚甲醛固定的样本常规石蜡包埋， 切片， 脱蜡，H2O2灭活，滴入0.01 mol/L 枸橼酸盐缓冲液，微波加热至沸腾，冷却，洗涤，BSA 封闭，滴入兔抗大鼠脏层腹膜组织中TGF-β1、CTGF 或α-SMA 多克隆抗体一抗，洗涤，山羊抗兔IgG 二抗，洗涤，BAD 显示，封片，镜检，并采用Imageproplus 6.0 软件进行数据提取与处理。1.3.3 观察指标 观察对比四组大鼠的体重变化情况、腹膜功能变化情况[超滤量（UF）、透析液尿素浓度（D）、血浆尿素浓度（Purea）、初始腹透液葡萄糖浓度（D0）、透出液葡萄糖浓度（D1）、计算D/Purea、D1/D0]、TGF-β1、CTGF、α-SMA 的表达变化情况、 各组大鼠血清细胞因子HGF、BMP-7、IL-6、VEGF 的变化情况。

1.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 17.0 对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t 检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组实验大鼠的一般情况变化

各组大鼠均正常进食、进水，无实验大鼠死亡，实验1 组和实验2 组大鼠有不同程度的脱毛、 竖毛现象；四组实验大鼠的体重在实验第1 天比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）；实验第4 周，模型组大鼠体重最高，组间比较差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

表1 四组大鼠的体重变化情况（g，±s）

表1 四组大鼠的体重变化情况（g，±s）

注：与对照组比较，*P ＜0.05；与模型组比较，#P ＜0.05；与实验1 组比较，▲P ＜0.05

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2.2 四组实验大鼠的腹膜功能测定情况

实验第4 周，模型组和实验1 组的腹膜功能指标UF、D/Purea、D1/D0测定值较对照组均有不同程度的下降，差异有统计学意义（P ＜0.05）；实验2 组与对照组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。 见表2。

表2 四组实验大鼠的腹膜功能测定情况（±s）

表2 四组实验大鼠的腹膜功能测定情况（±s）

注：与对照组比较，*P ＜0.05；与模型组比较，#P ＜0.05；与实验1 组比较，▲P ＜0.05； UF：超滤量； D：透析液尿素浓度； Purea：血浆尿素浓度； D0：初始腹透液葡萄糖浓度；D1：透出液葡萄糖浓度

组别 只数 UF（mL） D/Purea D1/D0对照组模型组实验1 组实验2 组F 值P 值10 10 10 10 10.4±0.5 4.9±0.8*7.2±1.1*#9.8±1.3#▲18.436 0.001 0.49±0.05 0.76±0.11*0.62±0.08*#0.51±0.04#▲7.066 0.032 0.74±0.09 0.39±0.07*0.63±0.06*#0.71±0.08#▲9.707 0.016

2.3 四组实验大鼠腹膜组织的纤维化细胞因子表达情况

与对照组比较，模型组、实验1 组、实验2 组的脏层腹膜组织中TGF-β1、CTGF、α-SMA 免疫组化检测结果均发生显著的变化，差异有统计学意义（P ＜0.05）；且实验1 组、 实验2 组较模型组的表达水平降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）。 见表3。

表3 四组实验大鼠腹膜组织的纤维化细胞因子表达情况（±s）

表3 四组实验大鼠腹膜组织的纤维化细胞因子表达情况（±s）

注：与对照组比较，*P ＜0.05；与模型组比较，#P ＜0.05；与实验1 组比较，▲P ＜0.05；TGF-β1：转化生长因子-β1；CTGF：结缔组织生长因子；α-SMA：α 平滑肌肌动蛋白

组别 只数 TGF-β1 CTGF α-SMA对照组模型组实验1 组实验2 组F 值P 值10 10 10 10 126.7±18.4 634.9±47.2*388.5±31.9*#226.5±27.3*#▲31.723 0.001 67.8±13.9 498.5±71.3*308.5±59.1*#187.4±46.4*#▲18.749 0.001 83.9±28.5 673.5±182.7*408.2±151.4*#276.3±98.9*#▲10.083 0.005

2.4 四组实验大鼠的血清纤维化细胞因子变化情况

模型组、实验1 组、实验2 组HGF、BMP-7、IL-6、VEGF 表达水平均较对照组显著升高，差异有统计学意义（P ＜0.05）；实验1 组、实验2 组的HGF、BMP-7、IL-6、VEGF 表达水平显著低于模型组， 差异有统计学意义（P ＜0.05）。 见表4。

表4 四组实验大鼠的血清纤维化细胞因子变化情况（ng/L，±s）

表4 四组实验大鼠的血清纤维化细胞因子变化情况（ng/L，±s）

注：与对照组比较，*P ＜0.05；与模型组比较，#P ＜0.05HGF：葡萄糖浓度及肝细胞生长因子；BMP-7：骨形态发生蛋白-7；IL-6：白细胞介素-6；VEGF：血管内皮生长因子

组别 只数 HGF BMP-7 IL-6 VEGF对照组模型组实验1 组实验2 组F 值P 值10 10 10 10 108.4±19.6 276.4±25.1*194.5±17.2*#148.5±16.6*#16.682 0.001 112.8±14.9 348.5±31.7*225.7±23.5*#183.9±27.4*#12.831 0.001 32.6±9.4 108.5±17.3*67.9±13.5*#47.8±14.7*#12.191 0.001 0.18±0.01 0.53±0.09*0.32±0.07*#0.26±0.06*#12.223 0.001

3 讨论

腹膜纤维化多见于腹膜透析中晚期，其病理学表现为腹膜间皮质细胞脱落、微绒毛丧失、细胞外基质沉积、细胞间隙增大、胶原纤维排列紊乱等[3]。 间皮细胞损伤是腹膜纤维化早期病变基础，随着透析时间的延长，透析液内的葡萄糖将进一步抑制间皮细胞的增殖，并同时干扰细胞外基质的代谢，导致腹膜间皮细胞形态改变，最终纤维化。 纤维化的腹膜将无法继续进行腹膜透析，这将影响患者的进一步治疗[4]。 因此，如何有效地降低腹膜纤维化成为腹膜透析治疗工作中的重点。

ATRA 是维甲酸的重要活性形式，可与维甲酸受体相互作用，进而调节、影响胚胎发育，对多种细胞（如肿瘤细胞、平滑肌细胞等）生殖、分化具有重要作用。 此外，ATRA 还具有抗炎及调节细胞外基质合成的功效。 近些年的研究显示，ATRA 在动物模型中具有极高的抗纤维化及细胞增殖能力，并开始应用于治疗成纤维细胞大量增殖相关皮肤疾病的防治中[5]。研究显示，ATRA 可通过调节肾脏组织的TGF-β1表达水平来影响细胞外基质代谢，降低血小板衍生因子水平，增强系膜细胞外基质金属蛋白酶的表达，最终延缓肾小球的硬化[6]。 为分析ATRA 对腹膜透析相关腹膜纤维化的影响， 本研究进行大鼠造模实验发现，模型组和实验1 组的腹膜功能指标UF、D/Purea、D1/D0测定值较对照组均有不同程度的下降， 提示腹膜透析对大鼠腹膜功能具有明显损伤，造模成功。 本研究发现，相比照组，模型组、实验1 组、实验2 组的脏层腹膜组织中TGF-β1、CTGF、α-SMA 免疫组化检测结果均发生显著的变化（P ＜0.05），实验1 组、实验2组较模型组表达水平更低（P ＜0.05）。 脏层腹膜组织中TGF-β1 是临床公认的强效致纤维化因子，参与着多种器官的纤维化过程。 TGF-β1主要由巨噬细胞、T淋巴细胞合成，具有多种生理功能，对细胞外基质的形成、血管的生成、炎症以及组织修复等均有重要作用[7]。 动物实验表明，大量注入TGF-β1腺病毒载体后，大鼠将出现明显腹膜增厚、血管新生以及间质细胞增殖情况， 其腹膜功能显著下降， 提示高表达的TGF-β1对腹膜纤维化具有重要作用[8]。CTGF 属于CCN家族的一员，具有促细胞增殖、调节细胞外基质、促细胞黏附及趋化的能力。 CTGF 可介导TGF-β1促纤维化，是腹膜及其他脏器纤维化的重要影响因子[9]。 α-SMA 是真核细胞的骨架蛋白，参与着微丝的构成，是细胞转化为成肌成纤维细胞的标志性蛋白。

本研究中还发现，模型组、实验1 组、实验2 组HGF、BMP-7、IL-6、VEGF 表达水平均较对照组显著升高（P ＜0.05），实验1 组、实验2 组的HGF、BMP-7、IL-6、VEGF 表达水平显著低于模型组（P ＜0.05）。HGF 是急性肝损伤动物血浆内的一种蛋白因子，对肝再生具有重要作用[10-11]。 体外实验表明，HGF 可降低、逆转肾间质纤维化、肝纤维化等脏器纤维化进程[12-13]。 BMP-7 是人体间充质细胞分化为骨、软骨、肌腱、韧带的重要诱导蛋白。 IL-6 是炎症因子的一种，可由间皮细胞或浸润的炎症细胞合成， 炎症是纤维化的重要病理诱因之一[14-16]。 VEGF 具有促腹膜血管生成能力， 对腹膜纤维化病理生理过程具有重要促进作用。

综上所述，TGF-β1、CTGF、α-SMA 等细胞因子是腹膜透析相关腹膜纤维化的重要影响因子，而ATRA可通过调节大鼠TGF-β1、CTGF、α-SMA 等细胞因子的表达来抑制腹膜纤维化过程，并维持大鼠腹膜功能。

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