HBsAg对健康成人外周血单核细胞来源树突状细胞Tim-3信号通路的影响

余真君 汤永志 燕飞 朱敏 朱坚胜

HBsAg对健康成人外周血单核细胞来源树突状细胞Tim-3信号通路的影响

余真君 汤永志 燕飞 朱敏 朱坚胜

目的 探讨HBsAg对健康成人外周血单核细胞来源树突状细胞（MD-DCs）的免疫活性及对T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（Tim-3）和下游信号分子核因子-κB（NF-κB）蛋白表达的影响。方法 分离健康成人外周血单核细胞，经GM-CSF、IL-4联合诱导为树突状细胞（DCs），流式细胞术检测DCs表面标志物表达水平。MD-DCs分4组添加不同浓度HBsAg（0、1、2、5μg/ml），分别设为对照组、+1μg/ml组、+2μg/ml组、+5μg/ml组，Western印迹法检测Tim-3、NF-κB信号蛋白表达，细胞增殖与毒性检测试剂检测MD-DCs刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力，ELISA法检测细胞因子分泌水平。结果 外周血来源单核细胞成功诱导分化为DCs。与对照组相比，+2μg/ml及+5μg/ml组MD-DCs Tim-3及NF-κB表达水平均上调，刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力均增强，炎症因子IL-6、IL-10、IFN-γ分泌水平均增高（均P＜0.05），而+1μg/ml组较对照组无统计学差异（均P＞0.05）。与其他3组相比，+5μg/ml组MD-DCs Tim-3、NF-κB、炎症因子分泌水平增高，刺激同种异体淋巴细胞增殖能力增强（均P＜0.05）。结论 HBsAg上调MD-DCs Tim-3及NF-κB表达水平，增强MD-DCs免疫活性，且刺激作用随HBsAg浓度的增高而增强。

树突状细胞 肝炎表面抗原，乙型 T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3 核因子-κB

【 Key words】 Dendritic cells Hepatitis B virus surface antigen T cell immunoglobulin and mucin domain-containing molecules-3 Nuclear factor-κB

HBV感染是世界范围内最常见的慢性病毒感染性疾病，与肝癌、肝硬化的发生、发展及预后密切相关[1]，目前约3.5亿人口罹患慢性HBV感染[2]，至今仍是全球健康卫生的难题。HBV并不直接造成机体细胞损坏，但可激活固有及获得性免疫反应，通过破坏或者紊乱机体的免疫功能，尤其是针对HBV的特异性抗病毒免疫功能，使得HBV逃避机体免疫攻击，进而形成持续感染[3]。树突状细胞（DCs）是体内强大的抗原递呈细胞，是沟通固有免疫反应和获得性免疫反应的桥梁[4]，调节免疫反应的重要组成部分[5]。很多数据表明慢性HBV感染患者DCs等细胞免疫功能障碍[6]，最新研究表明新生儿感染HBV后更易转为慢性感染可能为脐带血中髓系DCs、浆细胞样DCs浓度较低所致[7]。本研究采用健康成人外周血单核细胞来源树突状细胞（MD-DCs），加入HBsAg体外刺激，探讨HBsAg对MD-DCs免疫功能及T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（Tim-3）及下游信号分子核因子-κB（NF-κB）表达的影响。

1 材料和方法

1.1 材料 重组人粒系-巨系细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、重组人白细胞介素-4（rhIL-4）均购于美国R&D公司；抗人CD11c-APC、抗人PerCP-HLA-DR、抗人CD80-PE、抗人CD86-FITC及同型对照均购于美国Ebioscience公司；重组人HBsAg购于以色列Prospec公司；Tim-3一抗购于美国BioVision公司；NF-κB一抗、GAPDH一抗、羊抗兔二抗均购于美国Epitomics公司；细胞增殖与毒性检测试剂（MTS-PMS）购于美国Promega公司；IL-6、IL-10、IFN-γ酶联免疫吸附实验（ELISA）检测试剂盒均购于美国R&D公司；RPMI-1640培养基购于美国Hyclone公司；胎牛血清（FBS）购于美国Gibco公司；Ficoll淋巴细胞分离液购于上海华精生物高科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 MD-DCs体外诱导分化及流式鉴定 4h内采集的健康成人志愿者外周血100～200ml（所有志愿者身体状况均符合国家规定的体检要求，并在采血前均已签署知情同意书），经Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心法获得外周血单核细胞（PBMC），将PBMC分别加入至6孔板，每孔添加RPMI-1640培养基2ml重悬，培养箱中孵育2h，吸弃上清液并用4℃预冷PBS冲洗3次，获得贴壁的单核细胞。每孔加入含20%FBS的RPMI-1640培养基2ml，然后添加细胞因子（终浓度分别为rhGM-CSF 750U/ml、rhIL-4 800U/ml）培养，隔天半量换液，并补充细胞因子。培养至第7天，收集悬浮细胞，各加入流式标记抗体CD11c、HLA-DR、CD80、CD86及同型对照免疫标记，流式细胞仪（美国BD公司）检测各细胞表型表达水平；并将细胞分为4组，分别不添加HB－sAg（对照组）、添加HBsAg 1μg/ml（+1μg/ml组）、添加HBsAg 2μg/ml（+2μg/ml组）、添加HBsAg 5μg/ml（+5μg/ ml组）（每组3孔），培养至第9天后收集悬浮细胞。

图1 细胞培养至第7天时MD-DCs形态学观察所见（a：光镜下，×400；b：电镜下，×3 820）

1.2.2 Western印迹 收集各组悬浮细胞抽提蛋白，每孔总蛋白40μg上样，一抗（Tim-3、NF-κB、GAPDH）均1∶1 000孵4℃过夜，羊抗兔二抗（1∶10 000）室温孵育2h，增强化学发光显色，Quantlty One软件灰度值分析。

1.2.3 同种异体混合淋巴细胞反应 将已收集的4组悬浮细胞加入丝裂霉素C（25μg/ml）处理30min，离心、弃上清液，加入含20%FBS的RPMI-1640培养基重悬作为刺激细胞；刺激细胞与另一健康志愿者来源的淋巴细胞按不同比例（效靶比1∶5、1∶10、1∶20）加入96孔板，共培养96h；培养结束前4h，每孔加入MTS-PMS 20μl/孔，孵育4h，检测其吸光度（A）值。+1μg/ml组刺激指数（SI）=（+1μg/ml组A-本底A）/（对照组A-本底A）；其它组SI计算方法依此类推；SI数值越大代表DCs刺激淋巴细胞增殖能力越强。

1.2.4 ELISA 收集各组细胞上清液，ELISA法检测炎症因子IL-6、IL-10、IFN-γ分泌水平，按照说明书进行操作，酶标仪检测样品450nm处A值，绘制标准曲线并换算对应细胞因子的浓度。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以表示，组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 细胞培养至第7天时MD-DCs形态学观察及流式细胞术检测 见图1、表1。

由图1可见，PBMC培养至第7天时，细胞聚集形成集落，多呈悬浮状态，电镜下可见细胞形态不规则，细胞表面有毛刺，呈典型DCs形态。

表1 细胞培养至第7天时MD-DCs流式细胞术检测细胞表型阳性率（%）

由表1可见，收集悬浮细胞流式细胞术检测MDDCs特异性细胞表型CD11c、HLA-DR以及DCs成熟度细胞表型CD80、CD86，结果显示这些细胞表型阳性率均明显增高（均P＜0.01）；这表明单核细胞在加入rhGMCSF、rhIL-4共培养后，已成功诱导分化为MD-DCs。

2.2 各组MD-DCs Tim-3、NF-κB信号蛋白表达水平比较 见表2。

表2 各组MD-DCs Tim-3、NF-κB信号蛋白表达水平比较

由表2可见，与对照组比较，+2μg/ml、+5μg/ml组MD-DCs Tim-3（t=2.28、6.31，均P＜0.05）及NF-κB（t= 4.27、6.69，均P＜0.01）表达水平均增高，而+1μg/ml组信号蛋白表达水平无明显增高或降低（均P＞0.05）。与+1μg/ml组比较，+2μg/ml组MD-DCs Tim-3（t=2.68，P＜0.05）、NF-κB（t=4.98，P＜0.01）表达水平均增高。与+1μg/ml、+2μg/ml组比较，+5μg/ml组MD-DCs Tim-3（t=6.71、4.02，均P＜0.01）及NF-κB（t=7.40、2.42，均P＜0.05）表达水平均上调。

2.3 各组MD-DCs对淋巴细胞SI比较 见表3。

表3 各组MD-DCs对淋巴细胞SI比较

由表3可见，在效靶比1∶5情况下，+1μg/ml组MD-DCs对淋巴细胞SI与对照组比较无统计学差异（t=1.12，P＞0.05）；+2μg/ml组在效靶比1∶5情况下，其SI较+1μg/ml、对照组明显增高（t=6.62、7.75，均P＜ 0.01）；+5μg/ml组在效靶比1∶5、1∶10情况下，SI较+ 1μg/ml、+2μg/ml、对照组均增高（t=9.56、2.94、10.68、6.50、2.84、6.01，均P＜0.05）。

2.4 各组MD-DCs炎症因子分泌水平比较 见表4。

表4 各组MD-DCs炎症因子分泌水平比较（pg/ml）

由表4可见，与对照组比较，+2μg/ml、+5μg/ml组炎症因子IL-6（t=3.88、6.61，均P＜0.01）、IL-10（t=4.13、6.41，均P＜0.01）、IFN-γ（t=5.77、13.05，均P＜0.01）浓度均明显增高，+1μg/ml组炎症因子分泌水平无明显增高或降低（均P＞0.05）。与+1μg/ml组比较，+2μg/ml组IL-6（t=3.49，P＜0.01）、IL-10（t=4.50，P＜0.01）、IFN-γ（t=5.39，P＜0.01）升高。与+1μg/ml、+2μg/ml组比较，+ 5μg/ml组IL-6（t=6.21、2.73，均P＜0.05）、IL-10（t= 6.97、2.28，均P＜0.05）、IFN-γ（t=12.67、7.27，均P＜0.01）分泌水平均上调。

3 讨论

Tim-3与多种疾病如病毒感染、肿瘤、自身免疫疾病、过敏反应、移植免疫排斥反应等的发病机制相关[8]。Tim-3 mRNA最初发现高表达于人辅助性T细胞1（Th1），Tim-3被认为是Th1细胞特异表达的膜蛋白；后来越来越多的研究表明，CD8+T细胞、Th17细胞、调节性T细胞、巨噬细胞、NK细胞、DCs、肥大细胞等表面均可发现Tim-3表达[8]，最新研究发现Tim-3也表达于肿瘤细胞，并可能为肿瘤患者的独立预后因素[9]。Tim-3与其配体半乳糖凝甘素-9（Gal-9）结合可诱导细胞内钙流出，致使Th1细胞聚合、死亡，下调Th1免疫反应、诱导免疫耐受，抑制获得性免疫反应。然而在固有免疫反应中，Tim-3可能因为所处免疫环境的变化，促进或者抑制免疫反应；例如Anderson等[10]研究表明抗原递呈细胞表面Tim-3可协同Toll样受体（TLRs）促进促炎细胞因子的分泌，而Chiba等[11]发现肿瘤相关DCs过表达的Tim-3抑制核酸介导的固有免疫反应。

Tim-3信号分子在HBV感染的发病机制中起重要的免疫调节作用。研究表明慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血单核细胞、循环NK细胞、CD4+/CD8+T细胞上Tim-3信号蛋白表达水平较健康成人对照组均明显增高，阻断Tim-3信号通路可部分恢复NK细胞、CD8+T细胞等的免疫功能[12-13]，充分说明了过表达的Tim-3与CHB患者免疫功能障碍密切相关。CHB患者DCs免疫功能障碍，不能有效地提呈抗原给T淋巴细胞和B淋巴细胞，导致机体无法产生有效的抗病毒免疫反应是HBV持续感染的重要原因。HBV感染患者血液循环内存在大量HBV病毒微粒和病毒蛋白，尤其是HBsAg，病毒或病毒蛋白与DCs之间存在多元免疫反应[14]。本研究发现HBsAg体外刺激MD-DCs可上调Tim-3、NF-κB信号蛋白表达水平，增强其刺激淋巴细胞增殖能力和炎症因子IL-6、IL-10、IFN-γ等分泌水平，即HBsAg体外刺激增强MD-DCs免疫活性，且其刺激作用与HBsAg浓度相关；与本文研究结论相符。Jan等[15]发现HBsAg体外刺激MD-DCs,细胞表型CD80、CD83、CD86表达水平上调，可通过NF-κB、p38 MAPK信号通路促进IL-12、IL-10等炎症因子分泌。

在本研究中，HBsAg体外刺激MD-DCs，Tim-3表达水平上调，与MD-DCs免疫活性正性相关；且随着HBsAg刺激浓度升高，Tim-3表达水平亦相应上调。然而既往研究多表明高水平表达的Tim-3与CHB患者免疫细胞功能障碍相关，结合Tim-3信号分子在固有免疫反应中的双重调节作用，我们可以推测不同免疫环境下Tim-3扮演的角色也不同；例如有研究数据证实肿瘤患者体内高表达的Tim-3可能致患者DCs免疫功能障碍[11]，也有研究发现急性炎症反应中DCs表面Tim-3信号蛋白过表达并促进免疫应答反应[10]。慢性HBV感染者体内免疫内环境与体外单纯HBsAg刺激免疫环境之间的巨大差异，或许导致了Tim-3信号蛋白截然不同的免疫调节作用。

综上所述，体外环境下HBsAg上调MD-DCs细胞Tim-3及下游信号分子NF-κB蛋白表达水平，增强MD-DCs细胞免疫活性，且刺激作用随HBsAg浓度的增高而增强。CHB患者体内免疫环境下Tim-3对DCs免疫功能的调节作用，以及Tim-3对MD-DCs功能调节的确切机制均待进一步的研究。

[1]Trepo C,Chan H L,Lok A.Hepatitis B virus infection[J].Lancet, 2014,384(9959):2053-2063.

[2]Hatzakis A,Van Damme P,Alcorn K,et al.The state of hepatitis B and C in the mediterranean and balkan countries:Report from a summit conference[J].JournalofViralHepatitis,2013,20(2):1-20.

[3]Wang L,Zou Z Q,Liu C X,et al.Immunotherapeutic interventions in chronic hepatitis B virus infection:A review[J].Journal of ImmunologicalMethods,2014,407:1-8.

[4]Mildner A,Jung S.Development and function of dendritic cell subsets[J].Immunity,2014,40(5):642-656.

[5]Hanninen A.New Dimensions for Dendritic Cells[J].Duodecim, 2014,130(9):883-891.

[6]Li X,Wang Y,Chen Y.Cellular immune response in patients with chronic hepatitis Bvirus infection[J].MicrobialPathogenesis,2014, 74c:59-62.

[7]Hao H X,Zhang YL,LiMH,et al.Dendritic cellsubsets and function in newborns from mothers of different HBVinfection status[J]. Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi,2013,27 (2):112-114.

[8]Zhang XM,Shan N N.The role oft cellimmunoglobulin and mucin domain-3 in immune thrombocytopenia[J].Scandinavian Journal ofImmunology,2014,79(4):231-236.

[9]Jiang J,Jin M S,Kong F,et al.Decreased galectin-9 and increased Tim-3 expression are related to poor prognosis in gastric cancer[J].PloS One,2013,8(12):e81799.

[10]Anderson AC,Anderson D E,BregoliL,et al.Promotion of tissue inflammation by the immune receptor Tim-3 expressed on innate immune cells[J].Science,2007,318(5853):1141-1143.

[11]Chiba S,BaghdadiM,Akiba H,et al.Tumor-infiltrating dcs suppress nucleic acid-mediated innate immune responses through interactions between the receptor Tim-3 and the alarmin hmgb1 [J].Nat Immunol,2012,13(9):832-842.

[12]Wu W,ShiY,LiS,et al.Blockade of Tim-3 signaling restores the virus-specific CD8+T-cell response in patients with chronic hepatitis B[J].European JournalofImmunology,2012,42(5):1180-1191.

[13]Ju Y,Hou N,Meng J,et al.T cell immunoglobulin-and mucindomain-containing molecule-3(Tim-3)mediates natural killer cellsuppression in chronic hepatitis B[J].J Hepatol,2010,52(3): 322-329.

[14]Op den Brouw M L,Binda R S,Van Roosmalen M H,et al.Hepatitis B virus surface antigen impairs myeloid dendritic cellfunction:A possible immune escape mechanism of hepatitis B virus [J].Immunology,2009,126(2):280-289.

[15]Jan R H,Lin YL,Chen C J,et al.Hepatitis B virus surface antigen can activate human monocyte-derived dendritic cells by nuclear factor kappa b and p38 mitogen-activated protein kinase mediated signaling[J].Microbiology and Immunology,2012,56 (10):719-727.

Effects of hepatitis B virus surface antigen on Tim-3 signaling pathway of dendritic cells

YU Zhenjun,TANG Yongzhi,YAN Fei,et al.
Department of Infectious Diseases,Affiliated Taizhou Hospital of Wenzhou Medical University,Linhai 317000,China

Objective To investigate the effect of hepatitis B virus surface antigen(HBsAg)on the expression of T cell immunoglobulin and mucin domain-containing molecules-3(Tim-3)and the downstream signal molecule Nuclear Factor-κB (NF-κB)of human monocyte-derived dendritic cells(MD-DCs). Methods Monocytes obtained from normal adult peripheral blood were co-cultured with GM-CSF and IL-4 to induce to dendritic cells,the cell phenotypes expressions on MD-DCs were detected by flow cytometry.Different concentrations of HBsAg(0,1μg/ml,2μg/ml,5μg/ml)were added in the culture medium.The expressions of signaling proteins were determined by Western blotting assay,the lymphocytes-stimulatory capacity of MD-DCs was determined with a proliferation and cytotoxicity detection kit(MTS),and the concentrations of cytokines in the supernatant were determined by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA). Results Monocytes were successfully induced to dendritic cells.Compared with the control group,the expressions of signaling proteins Tim-3 and NF-κB of the HBsAg(2μg/ml or 5μg/ml) stimulation group were both up-regulated,the lymphocytes-stimulation capacity was enhanced,and the secretion levels of IL-6, IL-10 and IFN-γ were increased(P＜0.05),while there was no significant difference between 1μg/ml HBsAg stimulation group and control group.Compared with the other three groups,the treatment with 5μg/ml HBsAg led to increased expressions of Tim-3,NF-κB and cytokines,and enhanced lymphocytes-stimulation capacity of MD-DCs(P＜0.05). Conclusion HBsAg stimulation can increase the expressions of Tim-3 and downstream signaling molecule NF-κB of MD-DCs,and enhance the immune function of MD-DCs in a dose-dependent manner.

2015-02-13）

（本文编辑：李媚）

浙江省医药卫生科学研究基金计划项目（2010KYB125）

317000 临海，温州医科大学附属台州医院感染科（余真君、汤永志、燕飞、朱坚胜），公共科研平台（朱敏）

朱坚胜，E-mail：zhujs@enzemed.com