青海省不同纬度小檗属3种植物不同部位小檗碱变化规律研究*

向前胜，王 宁，赵 越，邹林有，孙 奎，王凯月

(1．青海大学，青海 西宁810016;2．青海省农林科学院，青海 西宁810016)

小檗科 (Berberidaceae)小檗属 (Berberis)植物全世界约有500种，我国约200种，西南、西北等地区均有分布。青海省是小檗属植物的重要分布区之一，有13种及1变种，西北小檗 (Berberis vernae)、鲜黄小檗 (B．diaphana)、直穗小檗(B．dasystachya)在青海省分布较广，资源量十分丰富［1］。

小檗属植物中所含的小檗碱是临床上常用的抗菌消炎药物之一，在中医药中有着很大的需求量［2～6］。目前小檗属植物利用方式主要是采用挖根法，存在资源破坏严重，利用率低的问题，加之对小檗植物化学资源状况不清，在利用上存在很大的盲目性，加剧了小檗资源的破坏和浪费。

由于环境因子对植物的生长发育和次生代谢产生着直接或间接的影响，因此，通过测定比较青海不同纬度3种小檗属植物各部位的小檗碱含量，旨在寻找小檗碱含量随纬度变化的规律，摸清小檗属植物小檗碱化学资源状况，为高效利用小檗属植物资源提供理论依据。

1 材料

1.1 样品的采集和制备

(1)样品采集 2014年9月，从青海省北纬39°12'57．15″～31°52'04．80″范围内分别采集3 种小檗属植物样品，经青海省农林科学院野生植物资源研究所鉴定为鲜黄小檗、直穗小檗和西北小檗。样品采集点情况见表1。标准地样方为20 m×20 m，每个种在样方内不同位置随机采5株。

表1 样方基本情况Tab．1 Descriptions of plots

(2)样品的制备 将采集到的新鲜小檗属植物根部泥土处理干净，自然干燥，按单株分别将根部、茎秆及枝梢分开，将5株同种植物同部位分别称取10 g混合，经粉碎机处理，过65目筛 (四号筛)，保存待测。

1.2 仪器和试剂

Waters ELSD 2424高效液相色谱仪 (Waters公司)，Welchrom C18色谱柱 (月旭材料科技上海有限公司)，BS214S电子天平 (德国 Sartorius公司)，微量移液器 (艾本德)，pH计 (上海大普仪器有限公司)，KQ3200DE型超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司)。

乙腈为色谱纯，山东禹王实业有限公司化工分公司生产;甲醇为色谱纯，美国fisher公司生产;磷酸二氢钠为分析纯，成都科龙化学试剂厂生产;盐酸小檗碱标准品 (HPLC测得含量≥98%):批号110713-201402，中国药品生物制品检定所生产。

2 方法

2.1 盐酸小檗碱含量的测定方法

本研究小檗碱含量的测定方法采用2010年版《中华人民共和国药典》中“三颗针”的含量测定方法［7］，每样品重复测定3次，取均值。

(1)色谱条件 色谱柱为Welchrom C18色谱柱(250 mm × 4．6 mm，5 μm);流动相为乙腈-0．02 mol/L磷酸二氢钠 (24︰76);流速1．0 mL/min，检测波长345 nm，柱温30℃。

(2)对照品溶液的制备与标准曲线 精密称取盐酸小檗碱标准品，加甲醇制成10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL 的 母液，用带有0．45 μm过滤膜的微孔针头取续滤液20 μL进样。精确吸取各浓度的标准样各20 μL注入液相色谱仪，按上述色谱条件进样测定，以峰面积 (Y)为纵坐标，标准品浓度 (X)为横坐标，绘制标准曲线。得回归方程为Y=4．99 e+004 X-1．08 e+005，R=0．999 277，结果表明，盐酸小檗碱在此条件下呈良好的线性关系。标准品色谱图见图1，5次进样峰面积值与浓度的标准曲线见图2。

图1 小檗碱标准品Fig．1 The reference substance of Berberine Hydrochloride

图2 标准曲线Fig．2 The standard curves of Berberine Hydrochloride

(3)供试品溶液的制备 取供试品粉末 (过四号筛)约0．1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

(4)样品测定 用带有0．45 μm过滤膜的微孔针头取供试样品续滤液20 μL进样，保留时间为16 min。

2.2 数据分析方法

采用 IBM SPSS Statistics 19统计分析软件及Excel 2007数据处理系统对不同纬度、不同种、不同部位小檗属植物中小檗碱含量之间进行统计分析。

3 结果与分析

表2为不同小檗种、不同纬度、不同部位小檗碱含量的HPLC测定结果与多重比较结果。

表2 不同纬度3种小檗属植物不同部位小檗碱含量的比较Tab．2 Comparison of different parts of Berberine in three kinds of Berberis with different latitude μg/mL

分析表2数据，对青海省不同纬度的3种小檗属植物各部位小檗碱的含量进行比较:不同纬度对3种小檗属植物体内各部位小檗碱的含量影响显著(P＜0．05)。其中小檗碱主要集中于小檗属植物的根部，在植株茎秆和枝梢部位也有分布。

西北小檗各部位小檗碱的含量在青海省采样范围内随纬度的升高呈现降低的趋势，尤其根部表现最为明显，最大值82．919 μg/mL是最小值17．057 μg/mL的4．86倍。

鲜黄小檗各部位小檗碱的含量在采样范围内随纬度的升高呈现增加的趋势，根部小檗碱的含量从14．526 μg/mL 到 51．217 μg/mL，增加了2．52 倍。

直穗小檗各部位小檗碱的含量在采样范围内随纬度的升高而呈现先增加后降低的趋势，其根部小檗碱的含量在东经 35°14'17．51″处达到最高值71．777 μg/mL。

3 结语

同种药用植物所含次生代谢产物含量的高低除与遗传因素有密切关系外，所生存的环境和气候条件等生态因子对其也有很大的影响［8～9］。随着纬度的变化，气候差异较大，植物的物候期不同，年生长周期中营养生长和生殖生长的起止时间也不同。即同一时期、同一无性系的生长发育、生理生化进程不一致，植物次生代谢物合成积累进程也不一致［10～12］。尤其在青海省境内，自然地理环境特殊，海拔高，地形差异显著，降水少，温差大，日照时间长，更加剧了纬度影响的差异。

本研究涉及青海省海东、海北、海南、黄南、玉树、果洛等地区，随着纬度的变化，不同种小檗属植物各部位小檗碱含量的变化规律不同:西北小檗随纬度升高而降低，鲜黄小檗随纬度的升高而增加，直穗小檗随纬度的升高呈现先增加后降低的趋势。

(1)从取样区所跨越的纬度范围来看，从南到北，随着纬度升高，年均温、降水量、日照时数逐渐减少，采样地所在低纬度地区海拔较高，立地条件恶劣，日照时间较长［13］，有助于小檗碱的积累，所以纬度较低地区的西北小檗体内小檗碱的含量相对较高。在青海海北门源，青海玉树1和青海玉树2三处采样点，由于所处海拔较高，引起相关生态因子的变化，其体内小檗碱的含量出现增加的现象。

(2)在青海省同一区域采样范围，鲜黄小檗的平均分布海拔要高于直穗小檗和西北小檗，其较适应高寒环境。由于树种的个体遗传因素的差异，同一纬度高海拔地区日温差较大，辐射较强，立地条件恶劣，所以鲜黄小檗体内小檗碱的含量随纬度变化的规律除与树种的区别相关外，还与周围的生态因素相关。在青海玉树州的3个采样点中，由于其分布海拔较高及局部环境的差异，导致该处鲜黄小檗体内小檗碱的含量出现增加的情况。

(3)从青海省内采样范围来看，直穗小檗分布地域有限，分布海拔介于其他两个种之间，随着纬度的升高，年均温降低，温度影响了植株体内的酶活性，加上树种、局部采样地海拔等因素的影响，使次生代谢的强弱产生了差异，从而产生了随纬度的升高呈现先增加后降低的现象。

对于小檗碱随着纬度变化的主要影响因子的分析，仍需进一步的研究，以期更好地解释小檗属植物体内小檗碱的含量随着纬度变化的规律。根据本研究的结论，建议青海省在低纬度地区对西北小檗植物资源进行开发利用，对高纬度地区进行鲜黄小檗植物资源的开发利用，在北纬35°的位置对直穗小檗植物资源进行开发利用。

［1］李耀阶．青海木本植物志(第1版)［M］．西宁:人民出版社，1987:201．

［2］Sona J，Lubos C，Silvia L．Berberine induces apoptosis through a mitochondrial/caspase pathway in human promonocytic U937 cells［J］．Toxicol In Vitro，2007，21(1):25．

［3］TIAN Shuo，WU Ting-ting．Pharmcologystudies of berberine on cardiovascular diseases［J］．Cap Med，2010，4(14):17．

［4］Leng SH，Lu FE，Xu LJ．Therapeutic efects of berberine in impaired glucose tolerance rats and its influence on insulin secretion［J］．Acta Pharmacol Sin，2004，25(4):496．

［5］吴劲东，李宝红，赵文昌．小檗碱制剂学研究进展［J］．中国当代医药，2013，12(1):14．

［6］金 青，赵文英，张国雨，等．注射用盐酸小檗碱脂质体的制备［J］．医药导报，2011，30(3):353-355．

［7］国家药典委员会．中华人民共和国药典(二部)［M］．2010 版．北京:化学工业出版社，2010．

［8］李 霞，阎秀峰，于 涛．滤光膜对黄檗幼苗生物量及初级氮同化酶活性的影响［J］．应用生态学报，2006，17(11):2020-2023．

［9］倪学斌，苏 静．丹参地上部分有效成分的初步分析［J］．中国药学杂志，2007，30(6):336-338．

［10］李伯刚，周 瑾．不同栽培模式黄山药新根茎生长量的比较研究［J］．天然产物研究与开发，1998，10(3):34-38．

［11］张桂贤，张淑晶，蔡云芝．黑龙江产三种芍药不同物候期的芍药甙含量测定［J］．中国林副特产，1999(1):4-5．

［12］张飞联，赵仕湘，吴爱娟，等．物候对益母草生长和总生物碱积累的影响［J］．中草药，2000，31(5):371-374．

［13］赵德修，李茂寅，邢建民．光质、光强和光期对水母雪莲愈伤组织生长和黄酮生物合成的影响［J］．植物生理学报，1999，25(2):127-132．