木犀草素抑制3T3－L1前脂肪细胞的分化

林 燕， 鲍 斌

（合肥工业大学 生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009）

木犀草素抑制3T3－L1前脂肪细胞的分化

林 燕， 鲍 斌

（合肥工业大学 生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009）

为研究木犀草素在3T3－L1前脂肪细胞成脂分化过程中的作用，文章探讨木犀草素抑制脂质沉积的作用机制，选取3T3－L1前脂肪细胞作为研究对象，在其分化过程中添加木犀草素，利用噻唑蓝（MTT）实验研究木犀草素对3T3－L1增殖的作用；利用油红O染色确定其对3T3－L1前脂肪细胞脂肪化的影响；利用定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测木犀草素对3T3－L1脂肪化相关基因的表达影响。结果表明，20μmol／L的木犀草素可以降低3T3－L1细胞的脂肪化，减少脂质聚集，并且降低了3T3－L1细胞中脂肪化相关基因Pparγ、C／EBPα、Ap2和Fas等基因的表达。

木犀草素；3T3－L1脂肪细胞；成脂分化；细胞增殖；基因表达

0 引 言

随着经济发展和人们生活方式的改变，肥胖作为一种全球性代谢疾病，在世界范围内迅速蔓延，并与多种疾病相关，危害着人类健康，其中包括Ⅱ型糖尿病、高血压、心血管疾病、粥样动脉硬化以及癌症［1－2］等。在肥胖发生过程中，脂肪细胞增生和增大导致脂肪组织中脂质过多累积，在脂质积累到一定限度后，会使得过量的脂质向非脂组织转移，从而导致这些正常代谢器官的病变，危害人类健康。因此，在肥胖过程中，有效抑制脂肪细胞中脂质积累是一种重要的抵抗肥胖的手段［3］。

黄酮类化合物是一类植物界普遍存在的多酚化合物，因为对人类的健康有益，而获得了广泛关注［4－5］。木犀草素是一种天然的黄酮类化合物，在多种可食用的植物中含量丰富，如芹菜、胡萝卜、香菜、辣椒及菠菜等［6］。木犀草素在中国传统的医学中主要被用于治疗炎症性疾病，如高血压和癌症等［6－7］。木犀草素可以通过口服给药吸收，在血浆中可以检测到低浓度的游离的木犀草素［8］，同时，由于其生物利用度较高及代谢率较低，使得木犀草素可以在体内安全地发挥其生物活性［6］。

已有一系列体内实验证明了木犀草素能够有效改善肥胖及与肥胖相关的胰岛素抵抗，包括饮食诱导的肥胖、基因缺陷导致的肥胖和化学诱导的糖尿病动物中胰岛素敏感性［9－15］。但木犀草素对脂肪细胞分化及相关基因表达影响的研究并不多，因此，本文拟采用3T3－L1前脂肪细胞作为研究对象，研究木犀草素对脂肪细胞分化的作用，检测并分析木犀草素的减肥降糖作用机理，并从基因的转录水平研究其调节机制。

1 材料与方法

1.1 材料

3T3－L1脂肪细胞购自北京协和细胞资源中心，木犀草素、IBMX（异丁基甲基黄嘌呤）、胰岛素、地塞米松、油红O染液购买自Sigma公司，胎牛血清（FBS）、新生牛血清（NBS）、DMEM（细胞培养基）高糖培养基购买自GIBCO公司，RNAiso Plus试剂、Oligo d（T）18、dNTP 、SYBRⓇ Premix Ex TaqTMⅡ试剂购买自TaKaRa公司，M－MLV逆转录试剂盒购买自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养

3T3－L1前脂肪细胞培养。细胞用含10%NBS的DMEM高糖培养液在5%CO2、37℃培养箱中培养，每2 d更换1次培养液，显微镜下观察细胞的生长状况，直至细胞生长接近80%融合时，用0.25%胰酶消化，接到24孔板中备用。

1.2.2 木犀草素对3T3－L1增殖的作用

胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调至（5～10）×104个／m L，于96孔板中，每孔接种细胞100μL，加入一定浓度的木犀草素。5%CO2、37℃孵育24 h，倒置显微镜下观察药物的作用效果。每孔加入10μL质量浓度为5 g／L噻唑蓝溶液（MTT），继续培养4 h。结晶可充分形成，将上清液去掉，每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值。

1.2.3 3T3－L1前脂肪细胞诱导分化

将3T3－L1细胞接种到24孔板中进行诱导分化。融合后2 d进行第1次诱导，加入含10%FBS、10μg／m L Insulin、0.5 mmol／L IBMX 和1μmol／L DEXA的DMEM。2 d后第2次诱导加入含10%FBS、10μg／m L Insulin的DMEM，然后用含10%FBS的DMEM维持4 d。20μmol／L的木犀草素在每次诱导时都同时加入，直至实验结束。

1.2.4 油红染色

诱导分化8 d后的3T3－L1吸出培养基，用磷酸蓝缓冲液（PBS）洗2遍，4%的甲醛暗处1 h固定细胞，然后用无菌水洗2遍，再用100%的1，2－丙二醇润洗2 min，加入0.5%油红染色暗处4 h，染色结束后，吸出染液，加入98%的1，2－丙二醇。85%丙二醇于脱色摇床上摇晃5 min 3次，加入1×PBS，倒置显微镜下观察脂滴形成情况并拍照。拍照完成后吸净PBS，加入200μL无水乙醇，于脱色摇床摇晃5 min，使油红溶出。每孔吸出150μL于96孔板中，检测OD510。

1.2.5 q－PCR检测成脂分化基因的表达

收集各组诱导分化后的细胞，用RNAiso Plus试剂提取总RNA，取2μg总RNA利用反转录酶试剂盒反转录成c DNA，并用实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）方法检测成脂相关基因的m RNA表达，PCR各基因引物见表1所列。以GAPDH作为内参照，分别计算各组2－ΔΔCT，用以表示Pparγ、C／EBPα、Ap2和Fas mRNA的相对表达量。

表1 定量PCR的引物序列

1.2.6 统计学处理

所有数据以均数标准差表示（重复3次试验，每组4孔细胞）。由SPSS13.0统计软件进行不同组之间的t检验，双侧P＜0.05为显著差异。

2 实验结果

2.1 木犀草素对3T3－L1增殖的影响

利用MTT方法研究木犀草素对3T3－L1前脂肪细胞增殖的影响，如图1所示。

图1 木犀草素对3T3－L1细胞增殖的影响

由图1可看出，较低浓度的木犀草素并不影响细胞的增殖，说明较低浓度的木犀草素对细胞的正常生长不产生影响。而本文研究的木犀草素对3T3－L1的脂细胞分化的作用是以不影响3T3－L1的正常生长为前提的，因此本文选择了20μmol／L的木犀草素为研究对象。

2.2 木犀草素对3T3－L1分化的作用

在3T3－L1诱导分化过程中加入20μmol／L的木犀草素培养8 d，利用油红O染色后的显微组织，如图2所示，由图2可知，20μmol／L的木犀草素能够抑制3T3－L1脂肪细胞的成脂过程，被染色的脂滴的含量明显减少。3T3－L1诱导分化后8 d油红O染色的吸光度结果如图3所示。

在510 nm吸收波长下检测光密度的结果表明，木犀草素对3T3－L1细胞脂肪化有显著的抑制作用。

图2 3T3－L1诱导分化后8 d油红O染色的显微组织

图3 3T3－L1诱导分化后8 d油红O染色的吸光度

2.3 木犀草素对脂肪化相关基因表达影响

C／EBPα（CCAT 增 强 子 结 合 蛋 白 α）和PPARγ（过氧化质体增殖激活受体γ）是3T3－L1细胞脂肪化的关键调控因子。AP2（脂肪细胞质结合蛋白）则是C／EBPα和PPARγ下游的目标基因，与成熟脂肪细胞的维持有关［11］。Fas（脂肪酸合成酶）是脂肪细胞内的主要酶。在诱导3T3－L1前脂肪细胞成脂分化过程中，加入20μmol／L的木犀草素处理8 d后显著抑制了这些脂肪细胞分化相关的基因m RNA的表达，如图4所示。

图4 20μmol／L木犀草素对3T3－L1脂肪细胞分化相关基因mRNA表达的影响

图4表明，木犀草素可以通过调节基因转录 表达抑制3T3－L1前脂肪细胞的成脂过程。

3 讨 论

肥胖是一种营养和能量过剩引起的慢性低度炎性疾病，伴随着各种炎性因子和抗炎因子分泌的失衡。脂肪组织，尤其是白色脂肪组织，不单储存能量，更具有重要的内分泌和免疫调节功能。其中，脂肪细胞参与能量代谢的调节在肥胖和其他慢性代谢疾病产生中起到重要作用［16］。预防和治疗肥胖的主要措施包括控制饮食、增强运动、补充功能性减肥食品、药物治疗和手术等。许多食品原料和天然产物能调节人体能量代谢平衡，改善脂肪组织功能，起到减肥的效果，是开发安全有效的功能性减肥食品的丰富资源，包括膳食纤维、茶叶、苦瓜、柑橘提取物、大豆皂甙、蓝莓、辣椒素、姜黄素、共轭亚油酸等［17］。

木犀草素是一种重要的黄酮类物质，大量的报道显示木犀草素对糖尿病、肝脏脂肪沉积和代谢综合症具有有效的改善作用［9－15］。本实验以3T3－L1细胞为研究对象，研究木犀草素对脂肪细胞分化的影响。实验结果表明，在3T3－L1脂肪分化的过程中添加不影响3T3－L1正常分化的20μmol／L木犀草素可以降低脂质的沉积，油红O染色结果表明细胞内脂滴聚集明显减少。此外，20μmol／L木犀草素也降低了脂肪细胞分化的关键转录因子C／EBPα（CCAT增强子结合蛋白α）和PPARγ（过氧化质体增殖激活受体γ）的表达。而 AP2（脂肪细胞质结合蛋白）则是C／EBPα和PPARγ下游的目标基因，与成熟脂肪细胞的维持有关，木犀草素的处理也显著降低了Ap2的表达。因此木犀草素对Ap2的抑制作用可能与下调Pparγ和C／EBPα基因表达有关。Fas（脂肪酸合成酶）是脂肪细胞内主要的酶，木犀草素的处理也显著降低了Fas的表达，说明木犀草素确实降低了3T3－L1细胞的成脂分化。

综上所述，实验证明了适当浓度的木犀草素能通过下调Pparγ、C／EBPα、Ap2和Fas基因表达来抑制3T3－L1细胞的成脂分化。木犀草素能够直接抑制脂肪细胞成脂分化，为其在降低肥胖中的作用提供了依据。

［1］Kopelman P G.Obesity as a medical problem ［J］.Nature，2000，404：635－643.

［2］Schuster D P.Obesity and the development of type 2 diabetes：the effects of fatty tissue inflammation［J］.Diabetes Metab Syn－dr Obes，2010，3：253－262.

［3］詹莉莉，杨志秋，傅正伟.肥胖与慢性炎症的研究进展 ［J］.中国细胞生物学学报，2011，33（3）：297－305.

［4］Barnes S，Prasain J.Current progress in the use of traditional medicines and nutraceuticals［J］.Curr Opin Plant Biol，2005，8（3）：324－328.

［5］Tormakangas L，Vuorela P，Saario E，et al.In vivo treatment of acute Chlamydia pneumoniae infection with the flavonoids quercetin and luteolin and an alkyl gallate，octyl gallate，in a mouse model［J］.Biochem Pharmacol，2005，70（8）：1222－1230.

［6］López－Lázaro M.Distribution and biological activities of the flavonoid luteolin［J］.Mini Rev Med Chem，2009，9（1）：31－59.

［7］Harborne J B，Williams C A.Advances in flavonoid research since 1992［J］.Phytochemistry，2000，55（6）：481－504.

［8］Zhou P，Li L P，Luo S Q，et al.Intestinal absorption of luteolin from peanut hull extract is more efficient than that from individual pure luteolin ［J］.J Agric Food Chem，2008，56（1）：296－300.

［9］Sismanopoulos N，Delivanis D A，Alysandratos K D，et al.Mast cells in allergic and inflammatory diseases［J］.Curr Pharm Des，2012，18（16）：2261－2277.

［10］Theoharides T C，Sismanopoulos N，Delivanis D A，et al.Mast cells squeeze the heart and stretch the gird：their role in atherosclerosis and obesity［J］.Trends Pharmacol Sci，2011，32（9）：534－542.

［11］张 弦，王友平，刘 璐，等.SRE元件报告质粒构建、转染和活性测定［J］.合肥工业大学学报：自然科学版，2014，37（1）：110－113.

［12］Kim J H，Lee E O，Lee H J，et al.Caspase activation and extracellular signal－regulated kinase／Akt inhibition were involved in luteolin－induced apoptosis in Lewis lung carcinoma cells［J］.Ann N Y Acad Sci，2006，1090：147－160.

［13］Karrasch T，Kim J S，Jang B I，et al.The flavonoid luteolin worsens chemical－induced colitis in NF－κB（EGFP）transgenic mice through blockade of NF－κB－dependent protective molecules［J］.PLoS One，2007，2（7）：e596.

［14］Ando C，Takahashi N，Hirai S，et al.Luteolin，a food－derived flavonoid，suppresses adipocyte－dependent activation of macrophages by inhibiting JNK activation［J］.FEBS Lett，2009，583（22）：3649－3654.

［15］Zhu D Q，Liu K，Yi J L，et al.Luteolin inhibits inflammatory response and improves insulin sensitivity in the endothelium［J］.Biochimie，2011，93（3）：506－512.

［16］Ouchi N，Parker J L，Lugus J J，et al.Adipokines in inflammation and metabolic disease ［J］.Nat Rev Immunol，2011，11（2）：85－97.

［17］Kim K H，Park Y.Food components with anti－obesity effect［J］.Annual Review of Food Science and Technology，2011，2：237－257.

Inhibiting the differentiation of 3T3－L1 adipocytes by luteolin

LIN Yan， BAO Bin
（School of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China）

In order to study the effect of luteolin on the differentiation of 3T3－L1 adipocytes，and the mechanism of inhibitory effect of luteolin on lipid deposition，luteolin was added into the medium of 3T3－L1 during differentiation.After differentiation，the effect of luteolin on 3T3－L1 proliferation was observed through MTT，and the effect on fat deposition was detected by oil red O staining.In addition，the expression of the genes during 3T3－L1 differentiation was determined by quantitative reverse transcription－polymerase chain reaction（RT－PCR）.The results show that luteolin of 20μmol／L can reduce 3T3－L1 adipocyte fat deposition，and decrease the expression of Pparγ，C／EBPα，Ap2 and Fas.

luteolin；3T3－L1 adipocytes；differentiation；cell proliferation；gene expression

Q254

A

1003－5060（2015）02－0254－04

10.3969／j.issn.1003－5060.2015.02.024

2014－02－21；

2014－03－20

中国博士后科学基金资助项目（2013M541817）；合肥工业大学青年教师创新基金资助项目（2012HGQC0019）

林 燕（1986－），女，安徽蚌埠人，合肥工业大学硕士生；

鲍 斌（1983－），男，河北石家庄人，博士，合肥工业大学讲师.

（责任编辑 闫杏丽）