超深低温冷冻与碳化二亚胺交联的同种异体肌腱修复兔跟腱损伤的实验研究

方 波 慈 元 宗 刚

大连市第二人民医院，辽宁大连 116000

超深低温冷冻与碳化二亚胺交联的同种异体肌腱修复兔跟腱损伤的实验研究

方 波 慈 元 宗 刚

大连市第二人民医院，辽宁大连 116000

目的寻找一种新的方法对同种异体肌腱进行进一步的预处理来改善其修复效果，为临床应用提供实验基础和理论依据。方法采用超深低温冷冻法获得兔同种异体肌腱，应用碳化二亚胺对其进行交联并肝素化，检测其组织相容性；将交联组和未交联组肌腱对兔跟腱损伤进行修复，观察并对比不同时间段两组的腱骨愈合情况。结果1、4周EDC交联组炎症反应分级（Ⅰ～Ⅱ）均较未交联组（Ⅲ～Ⅳ）轻，差异有统计学意义(P值分别为0.020、0.030)；移植实验可见交联并肝素化的肌腱在修复跟腱损伤中的愈合能力比未交联的肌腱强，Sharpey’s纤维出现早，缩短了腱骨愈合时间。结论经超深低温冷冻和EDC交联共同处理肌腱，增强其稳定性,降低了同种异体肌腱的免疫原性，促进肌腱与骨的愈合。

同种异体肌腱；超深低温冷冻；碳化二亚胺；移植

目前运动损伤、交通意外造成的跟腱损伤明显增多，处理这类损伤目前主要采用自体肌腱移植重建。由于自体肌腱取材时会造成一定程度的副损伤，且自体组织来源有限，使得同种异体肌腱的研究得以快速发展。而同种异体肌腱移植成功的关键是如何降低或抑制移植物的抗原性。该实验通过超深低温冷冻及应用碳化二亚胺处理肌腱以探求其降低同种异体肌腱抗原性的可能性，为进一步开展临床研究奠定基础，报道如下。

1 实验方法

1.1 同种异体肌腱的制备

实验于2011—2013年之间进行，取新西兰大白兔称重，按30 mg/kg用戊巴比妥钠静脉麻醉，无菌条件下取兔肌腱，生理盐水反复冲洗浸鲜肌腱置入由10%二甲基亚砜及纯小牛血清组成的冷冻保护液中,室温下平衡后置入液氮罐气液面6 h，再浸入液氮中贮存3个月。复苏:40℃水浴快速复温,含10%FCS的RPMI 1640液洗涤去除冷冻保护剂后在室温下浸泡在3%过氧化氢中3h后，用蒸馏水反复冲洗3次，30 min/次。将其放入1：1氯仿和甲醛混合溶液中脱脂 4 h,用蒸馏水反复冲洗 3次，30 min/次。真空冷冻干燥，环氧乙烷消毒备用。

1.2 同种异体肌腱的交联并肝素化

肌腱用50 mmol/L MES缓冲液浸泡24 h，与EDC交联液（含50 mmol/L MES,5 mmol/L EDC,5mmol/L NHS,用40%乙醇配制），室温交联6 h后，95%乙醇漂洗2次，30 min/次,PBS漂洗2次共24 h，Hepes缓冲液漂洗4次，20 min/次。真空冷冻干燥后,环氧乙烷消毒备用。

1.3 免疫原性实验

选取雄性SD大鼠40只,体重为(250±20)g。实验前背部剃毛,常规消毒,按0.35 mL/kg的水合氯醛进行腹腔内注射麻醉动物。实验分两组,每组20只。各组脊背皮下分别埋置上述两组肌腱（1组为EDC交联，2组为未处理组），3～0丝线缝合伤口,定期换药。分别于术后第1、4周以脱颈法个处死老鼠 10只，取大鼠皮下埋藏组织活检,HE染色观察移植大鼠皮下后的免疫反应。观察炎性反应分级[1]I级为试样周围未见或仅见少量淋巴细胞；II级为试样周围可见少量淋巴细胞；III级为试样周围可见少量嗜中性粒细胞、淋巴细胞浸润和巨细胞反应；Ⅳ级为试样周围可见以嗜中性粒细胞浸润为主的炎症反应，可见吞噬细胞。

1.4 同种异体肌腱移植

采用成年兔30只，随机分为两组，分别于双侧跟腱止点处切断[2]。1组为采用未处理的同种异体肌腱进行修复，2组采用超深低温冷冻及EDC交联并肝素化的同种异体肌腱移植进行修复。术后分别于1、3、6个月处死动物，取材作光镜和扫描电镜。

1.5 统计方法

采用SPSS 16.0统计软件实现，体内组织相容性实验的统计分析采用χ2检验。

2 实验结果

2.1 结果

①实验动物全部成活，手术切口均无感染和移植物排出。未交联组埋植于大鼠皮下组织1周，光镜下见肌腱变得疏松，纤维间隙增大，部分纤维变得模糊，基质周围组织水肿，大量炎症细胞浸润,炎症反应分级多为III～Ⅳ级，见图1。

图1 未交联组1周

②4周时，纤维组织大部分纤维碎裂，降解，正常的纤维排列结构消失，组织水肿消退，炎症细胞浸润减轻，但少量炎症细胞内部浸润，炎症反应分级多为II～III级，见图2。

图2 未交联组4周

③EDC交联并肝素化组埋于大鼠皮下后，1周取材表现为均质致密结构，周围炎症反应轻微，镜下见炎症细胞浸润，炎症反应分级I～III级，见图3。

图3 交联组1周

④4周取材时，结构仍为均质致密的纤维排列，但纤维间有大量的与纤维走行一致的细胞浸润，同时在其周围有大量的新生毛细血管形成。炎症反应分级为I～II级，见图4。

图4 交联组4周

⑤对4周取材的标本切片进行α-SMA免疫组化染色，可见EDC交联并肝素化的同种异体肌腱内部不均匀的棕黄色片状染色区域，提示其内部有表达α-SMA的细胞浸润多数为血管内皮细胞，见图5、6。

图5 α-SMA免疫组化染色

图6 α-SMA免疫组化染色

⑥数据表明1、4周EDC交联组炎症反应分级均较未交联组轻，χ2值分别为13.6、14.6，差异有统计学意义（P<0.001）。见表1。

表1 炎症反应分级

2.2 同种异体肌腱移植

2.2.1 组织学观察 术后1个月未处理组在肌腱于骨之间可见明显缝隙，存在少量的疏松结缔组织，见图7。

图7 未交联组手术后1个月

实验组肌腱和骨之间出现致密的结缔组织，可见少量排列紊乱的Sharpey’s纤维,但未愈合，见图8。

术后3个月未处理组在肌腱与骨之间出现排列无序的Sharpey’s纤维，有疏松结缔组织填充，但部分移植肌腱与骨之间仍有分离，以隧道内口较明显，见图9。

图8 交联组术后1个月

图9 未交联组术后3个月

实验组肌腱与骨隧道之间出现较多的排列有序的Sharpey’s纤维，并见纤维软骨填充，但无钙化软骨形成，见图10。

图10 交联组术后3个月

术后6个月未处理组在肌腱与骨之间出现较多的Sharpey’s纤维，部分排列有序，并出现纤维软骨填充，见图11。

图11 未交联组术后6个月

实验组隧道有较多的钙化软骨，隧道中部、外部可见明显的肌腱纤维、纤维软骨、钙化软骨、骨 4层结构，形成直接连接，部分区域如肌腱末端等结构相似，组织均匀，难以分辨清楚，见图12。

图12 交联组术后6个月

2.2.2 电镜 扫描电镜发现术后1个月，经超深低温冷冻及EDC交联的同种异体肌腱与骨的交界区纤维组织和骨组织间可见排列不规则的类胶原纤维样组织，在切面可见大量的红细胞存在，证明此区血管丰富，见图13。

图13 交联术后1个月

3个月时，交界区仍可见肌腱纤维排列紊乱，并有部分机化，有大量排列不规则的类胶原纤维，但界限不清，成骨的功能强，愈合能力强，可见成纤维细胞顺纤维走形嵌入，见图14。

图14 交联术后3个月

6个月时，交界区内可见，排列有一定的方向性的类胶原纤维，可见血管组织，并有大量的成纤维细胞和纤维母细胞，见图15。

图15 交联术后6个月

3 讨论

同种异体肌腱的预处理方式主要有冷冻、冻干和化学处理3种[3]，目前，冷冻处理是国内、外公认处理肌腱抗原性有效的方法。冷冻包括低温、深低温及超深低温，但降低肌腱抗原性,减轻免疫排斥反应同时使其抗张强度显著降低,且愈合过程完全依赖于外源性愈合,易产生严重粘连,影响术后效果[4]，且仍有较低的抗原性，存在潜在的风险。肌腱的化学处理主要采用低毒性的EDC，其作用机制是是“零长度交联”，在胶原间形成交联的同时，并不引入新的物质，降低抗原性的同时保持肌腱的生物稳定性[5-6]。该实验采用超深低温冷冻和EDC交联共同处理肌腱，寻求一种新的可行的降低抗原性提高生物稳定性的方法。

同种异体肌腱移植目前主要的问题有1肌腱的免疫反应问题2肌腱愈合问题。谷守滨等[7]研究表明：EDC交联同种异体肌腱能够降低其抗原性，增加其抗酶降解的能力，且无明显的细胞毒性。靳宪辉等[8-9]应用碳化二亚胺交联改性的脱细胞猪肌腱成功修复兔跟腱缺损，表明EDC交联同种异体肌腱有组织相容性好、移植排斥反应轻、生物力学性能强的优点。该研究免疫原性实验中发现EDC交联组肌腱镜下观察结构仍为均质致密的纤维排列，但纤维间有大量的与纤维走行一致 的细胞浸润，同时在其周围有大量的新生毛细血管形成。炎症反应分级为I-II级，较未交联组轻微。表明经超深低温冷冻和EDC交联共同处理肌腱具有低抗原性和良好的生物稳定性。肌腱与骨的愈合的特征是骨隧道内移植物与骨面间出现Shapery纤维。该实验通过移植物光镜下发现交联组在术后1个月出现Sharpey’s纤维，但量少且排列紊乱；3个月肌腱与骨隧道之间出现较多的排列有序的Sharpey’s纤维，并见纤维软骨填充，将肌腱与骨连接起来；6个月时隧道有较多的钙化软骨，隧道中部、外部可见明显的肌腱纤维、纤维软骨、钙化软骨、骨四层结构，形成直接连接。然而，未交联组Sharpey’s纤维，出现较晚。可见经超深低温冷冻和EDC交联共同处理肌腱愈合能力比未交联的肌腱强，缩短了腱骨愈合时间。

该文通过动物实验验证超深低温冷冻和EDC交联同种异体肌腱修复跟腱损伤的优越性，将其作为制备同种异体肌腱预处理步骤的提供了新的思路，其生物力学特性还有待进一步研究。

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Empirical Study of Rabbit's Tendon Allograft Obtained by Ultra-deep Frozen and Cross-linked by EDC/NHS Repairing Injure of Achilles Tendon

FANG BoCI Yuan ZONG Gang
Second People's Hospital of Dalian City,Dalian,Liaoning Province,116000,China

ObjectiveTo find a new way to improve the repairing effect by further pretreating tendon allograft so as to provide an experimental basis and theory evidence for clinical application.MethodsThe rabbit's tendon allograft was obtained by ultra-deep frozen then cross-linked and heparinized by EDC/NHS and detected histocompatibility.Injure of rabbit achilles tendon was repaired by the tendon allograft of management and nulli-management.The aim was to observe and contrast tendon-bone healing of two sets in the different time.ResultsEDC crosslinking group grade inflammation(Ⅰ～Ⅱ)was lighter than those of uncross-linked group(Ⅲ～Ⅳ)at 1 or 4 weeks，the difference was statistically significant(P values were 0.020,0.030);the transplantation showed that the capability of agglutination of the tendon allograft of management was more powerful than nulli-management set on repairing injure.The time of Sharpey's fibers appearing was earlier,and the cross-linking and heparinization process can shorten tendon-bone healing time.ConclusionTendon allograft obtained by ultra-deep frozen and cross-linked by EDC/NHS reinforces its constancy and reduces immunogenicity as well as promotes tendon-bone healing.

Tendon allograft;Ultra-deep frozen;Carbodiimide;Transplant

R686.1

A

1674-0742（2015）03（a）－0016-04

2014-11-25）

方波（1982.6-），男，吉林人，硕士研究生，主治医师，主要从事脊柱外科研究工作。