响应面法优化微波辅助提取广豆根中总黄酮工艺

兰艳素， 李长江， 亓昭鹏， 张 萍， 汪 奎

（黄山学院化学化工学院，安徽黄山245041）

响应面法优化微波辅助提取广豆根中总黄酮工艺

兰艳素， 李长江， 亓昭鹏， 张 萍， 汪 奎

（黄山学院化学化工学院，安徽黄山245041）

目的利用响应面分析法对广豆根总黄酮的提取工艺进行优化。方法通过单因素试验，考察微波功率、液料比以及提取时间对广豆根总黄酮得率的影响，并进行Box-Behnken实验设计，建立二次回归方程，应用响应面分析来确定微波辅助提取总黄酮的最佳工艺条件。结果最佳工艺条件为微波功率560W，液料比25∶1（mL/g），提取时间3min。在此条件下，总黄酮得率为9.454 mg/g，与预测值吻合。结论该方法简便、快速、可预测性较好。

广豆根；总黄酮；微波辅助提取；响应面法

广豆根为豆科植物越南槐Sophora tonkinensis Gapnep的干燥根及根茎，也叫做山豆根、小黄连等［1］，一般生长于石灰岩石缝中，在广西分布较多。药理活性实验显示，该植物具有消炎、抗氧化以及改善血管渗透性等多种活性［2-3］，常被用于治疗咽喉肿痛、心律失常和黄疸等病症，是我国传统的一味中药［4］。广豆根中的生物碱含量较高，另外还富含黄酮类成分，其中以二氢黄酮较为常见［5］。在前期工作中，课题组已对广豆根的化学成分进行了系统研究，并从中分离得到10个黄酮类化合物［6］以及一个新的异黄酮类化合物［7］。

提取中药有效成分的手段比较多，最常用的是乙醇回流提取法［8］，但该方法在实际操作过程中既耗时又费力。微波提取作为一种现代化技术，具有易操作、省时、省能等优点［9-10］，而且有效成分的提取率较高，所以已被应用于黄酮等有效成分的提取［11］。

但到目前为止，采用微波法辅助提取广豆根中总黄酮的研究尚未见报道。本实验将微波辅助提取技术应用于广豆根总黄酮的提取，并通过响应面法优化其工艺条件，为该植物资源的开发利用提供实验依据。

1 仪器与试剂

UV-2600型紫外可见分光光度计 （日本岛津公司）；MCR-3S型常压微波合成萃取仪 （巩义市予华仪器有限公司）；TG165高速离心机 （长沙平凡仪器仪表有限公司）；电子分析天平 （上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；GZX-9030 MBE电热鼓风干燥箱 （上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；FW100型高速万能粉碎机 （天津市泰斯特仪器有限公司）。

广豆根采于安徽岭南自然保护区，经黄山学院生命与环境科学学院方建新老师鉴定为豆科植物越南槐的干燥根及根茎；芦丁对照品购于中国药品生物制品检定所 （批号10080-200707）。所用试剂均为分析纯 （国药集团化学试剂有限公司）；水为超纯水 （自制）。

2 方法与结果

2.1 原料预处理 广豆根药材用清水洗净，阴凉处自然风干后放入干燥箱内，60℃下干燥24 h，粉碎备用。

2.2 标准曲线的制作 采用测定总黄酮的常规方法，并参考文献 ［12］测定提取液的吸光度。以吸光度值 （Y）为纵坐标，芦丁质量浓度 （X）为横坐标制作标准工作曲线，得线性回归方程Y=10.107X+0.045 9，r2=0.999 7，表明线性关系良好，满足实验要求。

2.3 样品溶液的制备与总黄酮测定 将称好的广豆根样品放入100mL圆底烧瓶中，并置于微波炉炉腔正中间，接上冷凝装置，在单因素以及Box-Behnken实验方案的条件下进行微波辅助提取，同时通入冷凝水以尽可能避免乙醇挥发引起的误差。提取液冷却后，离心机低速离心10 min，用移液管移取7 mL上层清液于50 mL量瓶中，定容，即得待测液。再移取其中5.0 mL于10 mL量瓶中，依次加入5%亚硝酸钠溶液、10%硝酸铝溶液、4%氢氧化钠溶液，乙醇定容至刻度线，摇匀，以不含芦丁的溶液为空白溶液进行调零，在510 nm处测定溶液吸光度值，每个实验点做3次平行实验，取平均值。

2.4 总黄酮提取率的计算 样品中总黄酮含有量以芦丁计，计算公式如下。注：C为标准曲线计算出的总黄酮质量浓度（mg/mL）；N为稀释倍数；V为提取液体积 （mL）；m为样品质量 （g）

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 精密吸取同一质量浓度芦丁对照品溶液1.0 mL，按照制作标准曲线的方法显色后，于510 nm处测定溶液吸光度，做5次平行试验，结果RSD为1.34%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 稳定性试验 精密吸取待测溶液5.0 mL，按照制作标准曲线的方法显色后，每隔15 min测定一次溶液的吸光度，结果RSD为1.42%（n=8），表明供试品溶液在2 h内稳定。

2.5.3 重复性试验 精密称取5份广豆根粗粉药材，每份1.0 g，按照 “2.3”项下方法制备待测液，显色后于510 nm处测定溶液吸光度，结果RSD为0.98%，说明重复性良好。

2.5.4 加样回收率试验 精密吸取6份广豆根提取液，总黄酮含有量均为0.756 mg/mL，分别加入等量的对照品，按照制作标准曲线的方法显色后，于510 nm处测定溶液吸光度，结果平均回收率为101.19%，RSD为1.78%。

2.6 单因素试验

2.6.1 乙醇体积分数对广豆根总黄酮得率的影响 液料比均为20∶1（mL/g），分别加入不同体积分数的乙醇溶液，浸泡30m in后置于微波炉炉腔中，微波功率设置为560W，50℃条件下提取3 min，所得提取液按照标准曲线的制作方法测定吸光度值，结果计算出的总黄酮得率分别为9.34、9.51、9.62、9.79、9.57 mg/g。可见其他条件不变时，随着乙醇体积分数的增大，黄酮得率先增加后减少，当体积分数为80%时得率最高。因此，本实验乙醇体积分数选择为80%。

2.6.2 微波功率对广豆根总黄酮得率的影响 液料比均为20∶1（mL/g），80%乙醇浸泡30min后置于微波炉中，设置提取温度为50℃，分别在320、400、480、560和640 W微波功率条件下提取3 min，所得提取液按照标准曲线的制作方法测定溶液吸光度值，结果计算出的总黄酮得率分别为9.89、10.26、10.36、10.56、10.39 mg/g。可见微波功率较低时，提取所得的总黄酮量也较少，当功率为560 W时得率最高，但随着功率进一步升高，得率却有所下降，可能是因为功率过高时会破坏化合物结构。因此，本实验微波功率选择为560W。

2.6.3 液料比对广豆根总黄酮得率的影响 称取6份广豆根药材粗粉，每份1.0 g，分别用10、15、20、25和30 mL 80%乙醇浸泡30min后，设置提取温度为50℃，560W微波功率条件下提取3 min，提取液按照标准曲线的制作方法测定溶液吸光度值，结果计算出的总黄酮得率分别为9.31、9.68、10.02、10.22、10.20、10.19 mg/g。可见液料比在10∶1～25∶1之间变化时，黄酮得率也随之迅速增加，并在25∶1处得率最高，但液料比进一步加大后，得率却无明显变化。因此，本实验液料比选择为25∶1。

2.6.4 提取时间对广豆根总黄酮得率的影响 各因素均采用优化后得到的最佳条件，即用25 mL 80%乙醇浸泡广豆根药材30 min后，在560 W微波功率条件下分别提取1、2、3、4和5 min，提取液按照标准曲线的制作方法测定溶液吸光度值，结果计算出的总黄酮得率分别为8.70、8.87、9.31、9.16、9.07 mg/g。表明随着提取时间增加，总黄酮得率迅速上升，在3 min时得率最高，但若提取时间过长，得率反而会降低。因此，本实验微波提取时间选择为3 min。

2.7 Box-Behnken实验设计水平及结果 通过单因素试验发现，在设定范围内，有3个考察因素 （微波功率、液料比和提取时间）对总黄酮得率影响较大，而乙醇体积分数则影响较小。因此，本实验选择微波功率、液料比和提取时间为自变量，总黄酮得率为响应值，进行三因素三水平Box-Behnken实验设计，因素水平表见表1。

表1 因素水平编码

称取广豆根药材，每份1 g，在Box-Behnken实验方案条件下提取，提取液经离心处理后测定吸光值，计算出总黄酮得率，结果见表2。

表2 实验设计与结果

表2数据经Design Expert 8.0.6软件回归分析，并进行拟合，得到以上3个实验因素对总黄酮得率影响的回归模型方程：Y=9.34-0.256A-0.159B-0.09C-0.05AB-0.533AC+0.098BC-0.7A2-0.375B2-0.538C2，方差分析结果如表3所示。

表3 方差分析结果

由表3可知，以上3个实验因素的P值均＜0.001，表明它们对总黄酮得率均有非常显著的影响。其中，微波功率影响最大，而提取时间影响则相对最小。另外在多次项中，微波功率和液料比之间的交互作用P值＞0.05，说明对得率影响不明显，除此之外，液料比和提取时间的交互作用、微波功率和提取时间的交互作用以及平方项对其影响均非常显著。

实验所得的回归模型P值＜0.000 1，说明实验因素对响应值的影响有极高的显著性。模型方程的相关系数r2= 0.99，且方程失拟项P值为0.252 8，表明该方程与真实实验点的拟合性较好，实验方法确实可信。

2.8 响应面分析 利用Design-Expert 8.0.6软件，以实验因素为横坐标，总黄酮得率为纵坐标，绘制交互作用的3D响应曲面，见图1～3。

图1 液料比与微波功率交互影响黄酮得率的响应面图

由图1可知，液料比与微波功率交互作用的响应曲面较为平滑，随着微波功率的升高以及液料比的增大，总黄酮得率先增加后减少，但变化程度不明显。当微波功率为560W，液料比为25∶1（mL/g）时得率最高，可达9.379 mg/g。

图2 提取时间与液料比交互影响黄酮得率的响应面图

图3 提取时间与微波功率交互影响黄酮得率的响应面图

由图2可知，提取时间与液料比交互作用的响应曲面开口往下，随着液料比的增大以及提取时间的延长，总黄酮得率先缓慢提高，当达到最大值后，开始缓慢降低。说明液料比和提取时间的变化对得率有一定影响，并且在合适条件下，可以使其达到最大值。

由图3可知，提取时间与微波功率交互作用的响应曲面比较陡峭，表明两者对总黄酮得率影响非常显著。当提取功率较小，提取时间较短时，得率较低，之后随着功率和时间的变化而迅速增加，在微波功率560 W以及提取时间3 m in处，响应值出现最高点，即得率最高。

2.9 广豆根总黄酮提取工艺的确定与验证 通过Design Expert软件对回归方程进行求解，可以得到微波辅助法提取总黄酮的理论最优条件是：微波功率546.5 W，液料比24.0∶1（mL/g），提取时间3.0 min，预测得率为9.379 mg/g。

称取5份广豆根粗粉，在优化的工艺条件下提取，提取液测定吸光度。结果计算出总黄酮的平均得率为9.454 mg/g，相对误差为0.8%，与预测值基本相符，说明该模型方程可靠。

3 讨论

为考察不同提取方法对提取效果的影响，本实验分别采用微波法和回流提取法辅助提取，结果发现两种方法下的广豆根总黄酮得率相当，但前者所需时间明显缩短，并且后者所需温度明显高于前者，黄酮类成分的结构可能会被破坏。因此，本实验选择微波法进行提取。

通过单因素试验来确定主要影响因素以及因素最佳水平，并设计Box-Behnken实验方案，利用响应面法对实验结果进行分析。结果优化得到的最佳提取工艺为：微波功率560W，液料比25∶1（mL/g），提取时间3min，在该条件下总黄酮得率为9.454mg/g。

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R284.2

：B

：1001-1528（2015）06-1360-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.047

2014-04-17

安徽省高校省级优秀青年人才重点项目基金 （2013SQRL088ZD）；安徽省高校省级自然科学研究项目 （KJ2011B168）；黄山学院自然科学基金项目 （2011xkj017）；黄山学院大学生科学研究项目 （2012xdkj074）

兰艳素 （1985—），女，硕士，助教，研究方向为天然有机化学。Tel：13685595775，E-mail：ls7536858@163.com