正交试验优选白术中白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅲ提取工艺

2015-01-16梁志远甘秀海张君勇练小卫

中成药 2015年6期

关键词：内酯白术乙醇

梁志远，甘秀海，吴坤，张君勇，练小卫

（1.贵州师范学院药用植物研究所，贵州贵阳550018；2.贵州师范学院化学与生命科学学院，贵州贵阳550018）

正交试验优选白术中白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅲ提取工艺

梁志远1，2，甘秀海1，2，吴坤2，张君勇2，练小卫2

（1.贵州师范学院药用植物研究所，贵州贵阳550018；2.贵州师范学院化学与生命科学学院，贵州贵阳550018）

目的优选白术中白术内酯Ⅰ和Ⅲ提取工艺。方法以白术内酯Ⅰ和Ⅲ的含有量为评价指标，选取料液比、乙醇体积分数、提取温度、提取次数为考察因素，通过正交试验优选白术中白术内酯Ⅰ和Ⅲ的提取工艺。结果最佳提取工艺条件为85%乙醇，料液比1∶12，在50℃下提取2次，每次30 min。结论该提取工艺操作简单、方便、安全，稳定性好，为白术中白术内酯的进一步研究提供科学依据。

白术；白术内酯；超声波；正交试验；提取工艺

白术为菊科植物白术Atracttylodesmacrocephala koidz的干燥根茎，性味甘、苦、温，具有健脾、益气、燥湿利水、止汗安胎等功效［1］。现代药理学研究表明，白术还具有抗炎、抗肿瘤、调节胃肠道功能和促进营养物质吸收的作用。白术主要产于浙江、安徽、湖南、湖北、江西、福建等地，以浙江磐安、鄞县、新昌地区产量最大，于潜所产品质最佳［2］。白术内酯Ⅰ和Ⅲ是白术的有效成分，也是白术药材质量控制的主要指标［3-5］。由于白术中白术内酯Ⅰ和Ⅲ含有量较低，性质又不太稳定，如何对其进行提取，一直受到人们的关注。目前用于白术内酯的提取方法有：有机溶剂冷或热浸提法、渗漉法、索氏提取法、超声波提取法，水蒸气蒸馏法和超临界 CO2萃取法等［6-8］，溶剂常用甲醇［9-11］。

超声波技术近年来发展非常迅速，具有省时、节能、高效等特点。该法是利用超声波产生的强烈振动、强烈的空化效应、搅拌等，造成植物组织细胞壁的破裂，增加溶剂渗入细胞组织，加快细胞内含物的释放，从而提高浸出率，缩短提取时间，同时可避免高温对提出成分的影响，被广泛用于中药有效成分的提取［12］。本研究以乙醇为溶媒，采用超声波辅助提取，考察了料液比、乙醇体积分数、提取温度、提取次数因素对提取率的影响。通过正交试验优化了白术内酯Ⅰ和Ⅲ的提取工艺，以期为白术内酯的进一步研究和开发利用提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪（美国惠普公司）；BSA124S型电子天平（北京慧龙环科环境仪器有限公司）；KQ3200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；RE-2000A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；XFB-200BC微型万能粉碎机（长沙市雨花区中诚制药机械厂）。

1.2 材料药材白术购于贵阳药材市场，经贵阳中医学院席先蓉教授鉴定为白术Atractylodesmacroeephala Koidz的根茎。白术内酯Ⅰ和Ⅲ对照品购于贵州省迪大科技有限责任公司（批号分别为GZ73069-12-3和GZ73030-71-4，纯度均大于99%）；甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，乙醇为食用级，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 白术内酯Ⅰ和Ⅲ测定

2.1.1 对照品溶液的配制分别精密称取白术内酯Ⅰ和Ⅲ对照品8.0 mg和10.0 mg，用甲醇溶解，置50 mL量瓶中并定容，制成白术内酯Ⅰ和Ⅲ质量浓度分别为160和200 μg/mL的混合对照品贮备液。

2.1.2 供试品溶液的制备精密称取过40目的白术粉末（50℃衡重4 h）0.5 g，置100 mL具塞锥形瓶中，加入95%乙醇20mL，在40℃下超声提取30min，提取液过滤，减压除尽乙醇和水，甲醇溶解，取上清液过0.45μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。

2.1.3 色谱条件 ZORBAXSB.C18色谱柱（150 mm× 4.6mm，5μm）；流动相为甲醇-水（65∶35）；体积流量1.0m L/m in；检测波长220 nm；柱温30℃；进样量10μL。色谱图见图1。

图1 白术内酯Ⅰ和Ⅲ对照品（A）和供试品（B）HPLC色谱图

2.1.4 线性关系考察分别精密吸取白术内酯Ⅰ和III混合对照品贮备液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得白术内酯I和III质量浓度分别为16、32、64、96、128、160μg/mL和20、40、80、120、160、200μg/mL的对照品溶液。在上述色谱条件下进行分析。以白术内酯对照品质量浓度（μg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，并进行线性回归，求得两种内酯回归方程，白术内酯 I：Y= 40.94X+74.431，r=0.999 7；白术内酯 III：Y= 26.078X+49.741，r=0.999 9。结果表明白术内酯Ⅰ和Ⅲ分别在16～160μg/mL和20～200μg/mL范围内峰面积积分值与质量浓度呈良好线性关系。

2.1.5 精密度试验精密吸取 “2.1.4”项下白术内酯Ⅰ和Ⅲ度分别为 64、80μg/m L混合对照品溶液，按“2.1.3”项下进行测定，重复进样5次，结果白术内酯Ⅰ和Ⅲ的RSD分别为0.77%和0.55%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验取同一供试品溶液分别在0、2、4、6、8 h进样，按 “2.1.3”项下测定，结果白术内酯Ⅰ和Ⅲ的RSD分别为1.63%和1.68%。表明供试品溶液在8 h内稳定。取一供试品溶液按 “2.1.3”项下测定，置于冰箱冷藏24 h后再测定，结果白术内酯Ⅰ和Ⅲ的RSD分别为1.72%和2.80%。表明供试品溶液置冰箱冷藏在24 h内仍能保持稳定。

2.1.7 重复性试验精密称取药材5份，每份0.5 g，按“2.2.3”项下方法平行制备供试品溶液，按 “2.1.3”项下测定。结果白术内酯Ⅰ和Ⅲ的RSD分别为1.36%和1.40%，表明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验精密称取已知含有量的白术药材6份，每份0.25 g，3份分别精密加入白术内酯Ⅰ和Ⅲ对照品贮备液2 mL（即白术内酯Ⅰ和Ⅲ各加320μg和400 μg），3份分别精密加入白术内酯Ⅰ和Ⅲ对照品贮备液3 mL（即白术内酯Ⅰ和Ⅲ各加 480μg和 600μg），按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按 “2.1.3”项下测定，结果见表1，结果表明方法的回收率较好。

表1 白术内酯Ⅰ和Ⅲ的加样回收率

2.2 白术内酯Ⅰ和Ⅲ最佳提取工艺的优选

2.2.1 超声提取单因素试验设计以提取液中白术内酯Ⅰ和Ⅲ的含有量为评价指标，考察单因素对提取率影响。精密称取过40目的白术粉末（50℃衡重4 h）0.5 g，在前期研究基础上，分别研究料液比1∶8、1∶10、1∶12、1∶14 4个水平，乙醇体积分数65%、75%、85%、95%4个水平，提取温度30、40、50、60℃4个水平，提取次数1、2、3次3个水平的单因素试验条件下，测定提取液中白术内酯Ⅰ和Ⅲ的含有量，得出各因素的最佳范围。

单因素试验显示，白术内酯Ⅰ和Ⅲ的提取率随料液比的增大有增高的趋势，当料液比达到1∶14时，白术内酯Ⅰ的提取率略有增加，但白术内酯Ⅲ的反而降低；随提取温度的升高白术内酯Ⅰ和Ⅲ的提取率也有增大的趋势，当提取温度达到60℃时，白术内酯Ⅰ和Ⅲ的提取率都降低。在考察超声时间对白术内酯Ⅰ和Ⅲ提取率的影响时，发现超声30 m in已基本提取完全。

2.2.2 正交试验设计在单因素试验基础上，确定料液比、乙醇体积分数、提取温度和提取次数四个因素的3个水平，采用L9（34）正交试验表安排实验，因素与水平见表2。

表2 因素水平

2.2.3 正交试验方法与结果精密称取过40目的白术粉末（50℃衡重4 h）9份，每份0.5 g，置100mL具塞锥形瓶中，按 “2.2.2”项下的正交试验方法超声提取，提取液过滤，减压除尽乙醇和水，残余物用甲醇溶解，转移至10 mL量瓶并定容，0.45μm滤膜过滤，得供试品溶液1～9号，然后按 “2.1.3”项下测定白术内酯Ⅰ和Ⅲ的含有量，并进行极差和方差分析。结果见表3～5。

表3 L9（34）正交试验结果（n=2）

表4 L9（34）正交试验结果分析

表5 方差分析

从表4极差R值看出，白术内酯Ⅰ和Ⅲ都是RB＞RC＞RA＞RD，即影响因素主次顺序为：乙醇体积分数＞提取温度＞料液比＞提取次数。从表4方差分析结果表明，对于白术内酯Ⅰ的提取：乙醇体积分数影响显著，料液比和提取温度有一定影响，提取次数影响甚微；对于白术内酯Ⅲ的提取：乙醇体积分数和提取温度影响非常显著，料液比有一定影响，提取次数影响甚微，即正交试验的极差分析和方差分析都显示，乙醇体积分数对两种内酯的提取结果有显著影响，为影响提取率的主要因素，提取温度和料液比为次要因素。综合考虑极差和方差分析结果，筛选出超声波辅助乙醇提取白术中白术内酯Ⅰ和Ⅲ的最佳工艺条件A3B2C3D2，即料液比1∶12、乙醇体积分数85%、提取温度50℃、提取2次，每次30 min。

2.2.4 验证试验精密称取过40目的白术粉末（50℃衡重4 h）6份，每份0.5 g，3份按优选出方法制备供试品溶液，3份按文献［13］的方法制备供试品溶液，按“2.1.3”项下测定，优选方法的结果为白术中白术内酯Ⅰ和Ⅲ的平均含有量分别为0.75 mg/g和1.41mg/g，文献方法的平均含有量分别为0.77mg/g和1.40mg/g。本研究又将量扩大到5倍，即取2.5 g白术粉末，按上述方法重复实验，优选方法的结果为白术内酯Ⅰ和Ⅲ的平均值分别为0.71mg/g和1.38 mg/g，文献方法的平均值分别为0.75 mg/g和1.39 mg/g，表明两种方法提取效率相当。

3 讨论与结论

在文献［9］的基础上，本研究考察了乙腈-水、乙腈-0.2%乙酸水、甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水等不同流动相系统，结果发现甲醇-水系统能获得分离度较好的色谱峰；进而探究了甲醇与水80∶20、70∶30、65∶35、60∶40，结果在甲醇与水65∶35的比列下，供试品溶液中白术内酯Ⅰ和Ⅲ峰间的分离度大于4，并能与杂质峰达到较好的基线分离，保留时间也较适合。

通过考察发现提取温度不宜过高，50℃比较合适，温度高于50℃提取率反而会降低。可能是两种白术内酯都不够稳定所致，因为白术内酯Ⅲ分子有个羟基，易发生分子内脱水生成白术内酯Ⅱ，另白术内酯Ⅲ与白术内酯Ⅰ可进行分子间脱水，生成双白术内酯［14-15］。

通过考察发现提取率随乙醇体积分数的降低而降低，乙醇体积分数为85%比较合适。可能是这两种内酯极性都不大，降低乙醇体积分数即增加溶媒的极性，导致它们在其中的溶解度降低。研究中还发现，随着乙醇体积分数的降低，极性杂质的溶出量增多，最后用甲醇定容时不溶物也随之增加，干扰测定。因此，乙醇体积分数相对高些，有利提高白术内酯Ⅰ和Ⅲ的提出率和纯度。

通过考察发现提取率随料液比的增大有增高的趋势，当料液比达到1∶14时，白术内酯Ⅰ的提取率略有增加，但白术内酯Ⅲ的反而降低。可能是料液比增加，相应水量增加，减压除去乙醇和水的时间延长，导致白术内酯Ⅲ发生分子内脱水转变成白术内酯Ⅱ。因此，料液比不宜太高。

本研究的方法与文献［13］的相比，最大的不同是用食用级乙醇代替文献中的甲醇作溶媒，虽然在提取时间、提取次数和溶剂用量方面也随着改变，但安全性提高了。从植物中提取有效成分，乙醇和甲醇都是人们常用的溶媒，乙醇的极性比甲醇稍弱，往往通过加适量的水来增加其极性，甲醇的沸点相对较低，除去方便。因此，在用量不大时人们更喜欢使用甲醇。但甲醇毒性较大，不宜工业化生产。

本研究采用超声波辅助提取法，其优点之一为高效、快速，可避免白术内酯Ⅰ和Ⅲ长时间处于较高温度下导致结构发生变化。另外，采用食用级乙醇作溶媒，所筛选出超声波辅助乙醇提取白术中白术内酯Ⅰ和Ⅲ的最佳工艺，方法合理可行，结果稳定，提取率高；所需设备简单，操作方便安全；适宜大规模工业化生产。

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