烫伤膏对大鼠深Ⅱ度烫伤创面修复作用及机制

韩 斌， 王志义

（1.辽宁医学院，辽宁锦州121000；2.锦州石化医院，辽宁锦州121000）

烫伤膏对大鼠深Ⅱ度烫伤创面修复作用及机制

韩 斌1， 王志义2

（1.辽宁医学院，辽宁锦州121000；2.锦州石化医院，辽宁锦州121000）

目的研究烫伤膏对大鼠深Ⅱ度烫伤创面的修复作用及作用机制。方法100只SD大鼠随机分为空白对照组，模型组，阳性对照组，烫伤膏剂组。对75只大鼠 （模型组，阳性对照组，烫伤膏剂组）背部造成深Ⅱ度烫伤，烫伤后立即给药，每日换药2次。每日肉眼观察创面瘀血水肿、痂下积脓，肉芽组织增生情况，定期测量创面愈合面积，计算创伤愈合率。分别于烫伤后7、10、14、21 d取材做病理切片以及表皮细胞生长因子 （EGF），碱性成纤维细胞生长因子 （bFGF）免疫组化切片。烫伤后48 h测量血清白细胞介素-1β（IL-1β）水平。结果烫伤膏剂组和阳性对照组的创伤愈合率明显高于模型组 （P＜0.05）。病理切片显示，烫伤膏剂组和阳性对照组与模型组相比，肉芽组织、表皮及真皮中汗腺形成速度明显增快。免疫组化切片显示，7、10、14 d烫伤膏剂组和阳性对照组的EGF、bFGF表达数量多于模型组 （P＜0.05）。烫伤后48 h，与模型组相比，烫伤膏剂组和阳性对照组的血清IL-1β水平明显减低（P＜0.05）。结论烫伤膏对大鼠深Ⅱ度烫伤创面有明显的促进修复的作用，其机制与增加EGF、bFGF的合成，降低血清IL-1β水平有关。

烫伤膏；大鼠深Ⅱ度烫伤；IL-1β；EGF；bFGF

由火焰、热液、电等物理因素和强酸、强碱等化学物质引起的组织损伤统称为烧烫伤，它是日常生活与工作中的常见病。近年来，中药在烧烫伤治疗应用上有了长足的发展，由辽宁中医药大学中医药实验中心研制的烫伤膏在临床中反复验证，对各种原因引起的烧烫伤具有良好的治疗效果，该膏剂由大黄、黄柏等中药组成，具有清热解毒、活血祛瘀及生肌敛疮的作用。本研究通过采用大鼠深Ⅱ度烫伤模型，进一步阐明烫伤膏的治疗作用，为其临床推广提供理论和实验依据。

1 实验动物和材料

1.1 实验动物 雄性SD大鼠100只，体质量180～200 g，生产许可证号 SCXK（辽）2003-0007，使用许可证号SYXK（辽）2003-00011。

1.2 药物和试剂

1.2.1 药物 烫伤膏剂由大黄、黄柏、熟地黄、骨碎补中药组成，辽宁中医药大学中医药实验中心提供。主要制作工艺流程：将处方中药物用8倍量的75%乙醇分别提取2次，回收乙醇，浓缩至1.25的浸膏；京万红软膏 （批号211974）由天津达仁堂京万红药业有限公司提供。

1.2.2 试剂 IL-1β酶联免疫检测试剂盒由上海源叶生物科技有限公司提供；EGF（批号20131209W）及bFGF（批号131111W）由北京博奥森生物技术有限公司提供；兔IgG—免疫组化试剂盒SABC即用型（批号NO.09c11B）及DAB显色试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.3 主要实验仪器 自备烫伤装置 （取用一块22 cm×11 cm×1 cm的木板，中间挖一个长轴4.3 cm，短轴3.3 cm的椭圆形孔），AS325型多功能切片机（英国SHANDON公司），Histocetre2包埋机（英国SHANDON公司），离心机（长沙湘仪离心机有限公司），DHG-9033BS-Ⅲ型电热恒温水浴箱 （上海圣科仪器有限公司），日本NIKON显微镜，秒表，电子天平。

2 方法

2.1 模型制备［1］取雄性SD大鼠100只，体质量180～200 g，用10%硫化钠脱毛，随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组、烫伤膏剂组。24 h后，取模型组、阳性对照组、烫伤膏剂组大鼠，用10%水合氯醛 （0.3 mL/100 g）麻醉大鼠，然后将大鼠仰卧固定在烫伤木板上，背部裸露的皮肤暴露在木板孔内，然后将木板放置在电热恒温水浴箱上，轻度按压木板使背部裸露皮肤浸入80℃水中15 s，随后立即注射灭菌0.9%氯化钠溶液 （2.5 mL/ 100 g）复苏，48 h后取创伤组织并制作病理切片，光境下观察，表皮及真皮乳头层损伤，真皮深层残留部分汗腺，细胞水肿，伴有大量炎细胞浸润，证实为大鼠深Ⅱ度烫伤。

2.2 分组给药 烫伤后的大鼠单笼饲养，模型组，阳性对照组，烫伤膏剂组3组，每组25只。创面每日换2次药，生理盐水冲洗后，阳性对照组外敷京万红软膏，烫伤膏剂组外敷烫伤膏，给药部位用无菌纱布缝扎固定，连续21 d。

3 观察指标

3.1 创面愈合率 烫伤后1、7、14、21 d用透明硫酸纸描记创面，以此为模板，将质地均匀的硬纸板剪成同样大小，然后用电子天平称定质量，以质量代替面积，依据创面愈合率=（原始烫伤面积-各时间点未愈合面积）/原始烫伤面积［2］，计算创伤愈合率。

3.2 大体形态观察 每日观察并记录各组大鼠创面淤血水肿、结痂及痂皮脱落、上皮化等创面情况。

3.3 病理组织学观察 分别于烫伤后7、10、14、21 d，每组取5只大鼠，切取创面外缘皮肤，经福尔马林固定后，石蜡切片，切片用于免疫组化和HE染色，对于HE染色的切片，需要观察不同时间点创伤皮肤表皮再生、真皮中汗腺、炎细胞浸润、肉芽组织中毛细血管及成纤维细胞生长情况。

3.4 EGF、bFGF表达测定 切片经脱蜡，3%过氧化氢浸泡，高压修复，封闭液孵育，加入EGF、bFGF抗体后，再先后加入羊抗兔、SABC，之后DAB显色，苏木素复染及脱水透明封片。显微镜下观察EGF、bFGF阳性细胞的胞浆呈现棕黄色或棕褐色颗粒。在高倍镜下每张切片选取3个视野，每个视野100个细胞，观察并记录100个细胞中阳性细胞数，计算平均值。

3.5 烫伤大鼠血清制备及血清IL-1β测定 烫伤后48 h，每组取大鼠5只，10%水合氯醛麻醉后，经腹主动脉取血，3 500 r/m in离心15 min，取上清液后，根据ELISA试剂盒中提供的操作步骤测定血清IL-1β水平。

4 统计学处理

计量资料以x±s表示，应用SPSS 13.0软件进行处理，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD法，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

5 结果

5.1 创面愈合率 与模型组相比，阳性对照组和烫伤膏剂组在烫伤后7、14、21 d创面愈合率明显升高，并且有显著性差异 （P＜0.05）。此结果表明烫伤膏对深Ⅱ度烫伤大鼠创面有明显修复作用，见表1。

表1 各时间点创面愈合率比较 （%，x±s，n=5）

5.2 大体形态观察 空白对照组大鼠精神饮食活动正常，脱毛处为正常皮肤，无肿胀变白。各组大鼠烫伤后精神萎靡，饮食减少，创面苍白，略肿胀，与周围组织分界清楚，皮肤弹性降低，韧性增加。烫伤后24 h，模型组、阳性对照组、烫伤膏剂组大鼠精神状态逐渐恢复，饮食量逐渐增加，创面瘀血，呈点片状，肿胀明显，结硬痂，痂下有积脓。烫伤后7 d，模型组、阳性对照组、烫伤膏剂组大鼠精神食欲恢复正常，空白对照组大鼠脱毛处新生白毛，模型组创面呈少量点状瘀血，水肿不明显，硬痂变软，痂皮脱落不明显，痂下积脓明显；阳性对照组和烫伤膏剂组创面无瘀血水肿，硬痂变软，创面周边部分痂皮有脱落。烫伤后14 d，空白对照组大鼠脱毛处基本恢复脱毛前状态，模型组创面无瘀血水肿，创面痂皮部分脱落，已脱落表面不平坦；阳性对照组和烫伤膏剂组创面痂皮大部分脱落，脱落部分露出新鲜肉芽组织，表面光滑平坦。烫伤后21 d，模型组创面痂皮大部分脱落，表面不光滑；阳性对照组和烫伤膏剂组创面大部分被表皮覆盖。

5.3 病理组织学观察 空白对照组在7 d，14 d及21 d组织切片表现为表皮层次分明，真皮中大量汗腺生长，充满大量呈编织状胶原纤维。烫伤后7 d，阳性对照组及烫伤膏剂组模型组坏死组织部分脱落，并且有成纤维细胞及毛细血管生成；模型组坏死组织开始从创缘剥脱，坏死组织与创缘交界处有大量炎细胞浸润。烫伤后14 d，阳性对照组和烫伤膏剂组大部分坏死组织脱落，表皮爬行于创缘表面，有较多成纤维细胞及毛细血管的生成；模型组部分坏死组织脱落，表皮爬行速度缓慢，与阳性对照组及烫伤膏剂组相比，有较少成纤维及毛细血管的生成。烫伤后21 d，阳性对照组和烫伤膏剂组表皮基本覆盖创缘表面且表皮结构成熟，真皮内有大量汗腺生成，成纤维细胞产生大量较多胶原纤维，同时成纤维细胞数量减少、胞核变细长，变为纤维细胞，并且毛细血管数量减少；模型组坏死组织全部脱落，表皮尚未全部覆盖创面，表皮下有成纤维细胞及毛细血管。见图1。

图1 大鼠烫伤后各时间点创面组织病理切片 （×100）

5.4 EGF、bFGF表达 烫伤后7、10、14 d，阳性对照组和烫伤膏剂组EGF、bFGF表达高于模型组，差异具有统计学意义 （P＜0.05）。烫伤后21 d，差异无统计学意义（P＞0.05），烫伤后7、10、14、21 d阳性对照组和烫伤膏剂组EGF、bFGF表达差异无统计学意义（P＞0.05），见表2﹑表3及图2、图3。

表2 每组各个时间点EGF阳性细胞数量比较 （个，x±s，n=5）

表3 每组各个时间点bFGF阳性细胞数量比较 （个，x± s，n=5）

图2 大鼠烫伤后第10天各组创面组织EGF表达

图3 大鼠烫伤后第10天各组创面组织bFGF表达

5.5 血清IL-1β水平 从表4中可见，烫伤后48 h烫伤膏剂明显降低大鼠血清IL-1β水平，与阳性对照组相比差异无统计学意义 （P＞0.05），同模型组比较差异具有统计学意义 （P＜0.05）。

表4 烫伤后48 h IL-1β比较（x±s，n=5）

6 讨论

创面愈合过程主要包括炎症反应期，细胞增殖期及结构重塑期。组织损伤后，中性粒细胞和单核巨噬细胞等多种炎症细胞向创面聚集，进入创面的单核巨噬细胞合成并分泌多种生长因子。这些生长因子刺激成纤维细胞及内皮细胞迁移至创面，并且不断增殖。启动增殖过程后，内皮细胞及成纤维细胞持续合成并分泌多种生长因子，进一步促进创面愈合。EGF及bFGF是生长因子家族中的重要成员。其中EGF是一种多肽类物质，可刺激表皮角质细胞和纤维细胞增殖，促进新血管的形成和核酸蛋白质的合成。而bFGF主要促进成纤维细胞及内皮细胞增殖，进而促进肉芽组织形成及新生毛细血管化［3-5］。由实验结果可知，烫伤后7、10、14 d，阳性对照组和烫伤膏剂组EGF、bFGF表达高于模型组，差异具有统计学意义 （P＜0.05），说明京万红和烫伤膏促进细胞合成和分泌EGF、bFGF，进而加快肉芽组织形成和上皮化速度，促进创伤愈合。

严重烧伤后中性粒细胞 （PMN）等炎症细胞活化，释放大量细胞因子等炎症介质，这些炎症介质与创伤后全身性炎症反应的关系密切［6］。曾经发现部分创 （烧）伤患者血液中PMN的凋亡受到明显抑制［7-8］。延迟凋亡的PMN积聚于组织中，坏死脱颗粒时可释放大量毒性物质，例如酶类和超氧离子，引起细胞变性坏死，进而促进多器官功能衰竭 （MODS）［8］，因而创伤后局部炎症反应持续存在并加重的关键因素是PMN凋亡延迟［9］。我们认为从整体角度看，严重烧伤后释放的IL-6和IL-1等细胞因子，是引起创伤后PMN凋亡延迟的重要影响因素。本实验结果表明，烫伤后1 d，烫伤膏剂及京万红明显降低血清中IL-1β水平，同模型组比较差异具有统计学意义 （P＜0.05），说明烫伤膏剂抑制IL-1β生成，解除PMN凋亡延迟，减轻炎症反应，促进创面愈合。

综合上述，烫伤膏剂增加EGF和bFGF的合成，同时抑制血清IL-1β生成，促进创面愈合。

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R285.5

：B

：1001-1528（2015）06-1335-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.040

2014-07-20

韩 斌（1987—），硕士生。Tel：18241651013，E-mail：1792360568@qq.com

*通信作者：王志义，硕士生导师。