补肾壮阳类中成药中非法添加物PDE5抑制剂的分离鉴定

黄国栋， 黄艳婷， 陈 林， 雷 毅*， 张 荣*

（1.广东药学院药科学院，广东广州510006；2.广东省食品药品检验所，广东广州510180）

［成分分析］

补肾壮阳类中成药中非法添加物PDE5抑制剂的分离鉴定

黄国栋1， 黄艳婷2， 陈 林1， 雷 毅2*， 张 荣1*

（1.广东药学院药科学院，广东广州510006；2.广东省食品药品检验所，广东广州510180）

目的研究补肾壮阳类药物中非法添加物的提纯与结构鉴定，为国内研究补肾壮阳中成药及保健品中非法添加物提供技术支持和相关谱图数据。方法使用薄层色谱、柱色谱、高效液相色谱对非法添加物进行分离和提纯；使用核磁共振、质谱确定非法添加物的化学结构。结果提纯得到黄色针状结晶，纯度为97%，化学结构确定为5-﹛5-［4-（2-羟乙基）哌嗪磺酰］-2-正丙氧基苯基﹜-1-甲基-3-正丙基-1H-吡啶并 ［4，3-d］嘧啶-7（6H）-硫酮。结论

补肾壮阳；非法添加物；PDE5抑制剂；分离鉴定；5-﹛5-［4-（2-羟乙基）哌嗪磺酰］-2-正丙氧基苯基﹜-1-甲基-3-正丙基-1H-吡啶并 ［4，3-d］嘧啶-7（6H）-硫酮

PDE5（磷酸二酯酶5型）抑制剂是一种治疗男性阳痿和勃起功能障碍的药物［1］。目前，在美国FDA批准的PDE5抑制剂药物仅有西地那非（伟哥©）、伐地那非 （艾力达©）和他达拉非 （希爱力©）3种，但对心血管疾病和糖尿病患者有严重不良反应［2-3］，因此必须在医生指导下使用。由于西地那非的特殊用途和高额利润，一些不法分子在壮阳类中成药和保健食品中非法添加其原料以牟取暴利［4］。近年来，随着国家查处力度的不断加强，不法分子通过非法添加西地那非同系物的隐蔽方式来逃避监管。自2003年至2013年的10年间，有50多种PDE5抑制剂衍生物被陆续报道［5］，如西地那非的新衍生物豪莫西地那非［6］、红地那非、羟基豪莫西地那非［7］、羟基红地那非［8］、那红地那非［9］、硫代西地那非、硫代豪莫西地那非、伪红 地 那 非［10］、氨 基 他 达 拉 非［11］、Benzamidenafil［12］等，这类未经安全检验的非法添加物将会对消费者的身体健康带来极大的威胁［13-16］。本实验采用色谱方法从样品勃尔特胶囊中分离得到一种非法添加的新西地那非衍生物，之后应用核磁和质谱，确定该成分的化学结构为5-﹛5-［4-（2-羟乙基）哌嗪磺酰］-2-正丙氧基苯基﹜-1-甲基-3-正丙基-1H-吡啶并［4，3-d］嘧啶-7（6H）-硫酮，为首次报道。

1 实验材料

1.1 试药和试剂 勃尔特胶囊 （0.4g×16粒），批号110902，购于互联网。甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、正己烷、氨水均为分析纯 （国药集团化学试剂有限公司）；硅胶 （300目，青岛海洋化工有限公司）；蒸馏水 （自制）。

1.2 仪器 LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Advance DMX500全数字化超导核磁共振谱仪（500 MHz，瑞士Bruker公司）；液相色谱—质谱联用仪（美国Waters公司）。

2 实验

2.1 柱色谱分离 取1粒胶囊内容物，约0.3 g，置于20 mL具塞锥形瓶中，甲醇10 mL溶解，超声提取15 min，冷却至室温，0.45μm微孔滤膜滤过，即得滤液。往滤液中加入0.9 g硅胶，搅拌均匀，旋转蒸发仪上浓缩蒸干，即得供试品粉末拌样硅胶，备用。取300目硅胶50 g湿法装柱，然后干法上拌样硅胶，以乙醇-丙酮-正己烷-氨水 （5∶20∶60∶1）为洗脱剂淋洗，洗脱体积流量 1 mL/min。收集前2条色带的洗脱溶液，每5 mL收集1瓶，共70瓶，分别点于硅胶GF254（10 cm× 10 cm）上，乙醇-丙酮-正己烷-氨水 （5∶20∶60∶1）展开，在紫外光波长254 nm处观察荧光情况。之后将Rf值相同的洗脱液合并，旋转蒸发仪上浓缩蒸干，置通风橱中静置结晶。

2.2 液相色谱条件 采用YMC-C18（250 mm× 4.6 mm，5μm）色谱柱；二极管阵列检测器，扫描波长范围200～400 nm；柱温35℃；体积流量1.0 mL/min；进样量10μL；流动相A为磷酸三乙胺溶液 （取三乙胺7 mL，加水稀释至1 000 m L，再用磷酸调pH至2.8，即得）-甲醇-乙腈 （60∶20∶20），流动相B为磷酸三乙胺溶液-甲醇-乙腈（8∶46∶46），梯度洗脱顺序参照 《国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件 （2009030）》，见表1。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Program of gradient elution

2.3 质谱条件 采用电喷雾离子化源 （ESI）正离子检测模式，碰撞电压46 V，扫描方式为全扫描一级质谱、选择离子全扫描二级质谱。

2.4 核磁共振光谱检测 氘代二甲基亚砜（DMSO-d6）为溶剂，四甲基硅烷 （TMS）为内标。

3 结果和讨论

3.1 高效液相色谱研究 高效液相色谱结果见图1。由图可知，在保留时间tR=30.129 min处，主成分按峰面积归一化法计算，测得纯度为97.6%，色谱纯度指数为0.971，表明能达到核磁共振的分析纯度要求。

图1 样品HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of sample

3.2 质谱研究 通过柱色谱分离得到的晶体纯度高达97%，并应用液质联用技术得到该晶体的质谱图，见图2。

图2 样品MS谱Fig.2 M ass spectrum of sam p le

样品的［M+H］+峰m/z为535.3，二级质谱主要裂解碎片m/z分别为517.3、359.3、341.4、315.2、 299.0、271.1、129.3、 112.3、 99.2、84.2和58.3。其中，m/z 299.0和99.2是硫代西地那非类物质的特征碎片离子峰［17］，推测样品是硫代西地那非类，结构见图3。另外，其分子质量与样品分子质量相差44，推测样品比硫代西地那非多2个CH2和1个氧原子。样品质谱图中出现517.3（M-18）峰，为分子脱去1个水分子所致，推测样品分子中含有羟基。硫代西地那非以砜基团O=S=O为中心发生异裂，产生m/z 327的离子峰，然后苯环上的乙氧基脱去C2H4，形成m/z299的特征离子峰，见图4。样品的质谱中未出现m/z 327峰，而被m/z341峰取代，推测在样品的苯环上有1个丙氧基，另外，其CH2和OH连接在哌嗪环一侧。综上所述，可推得样品具体结构，见图5。

图3 硫代西地那非Fig.3 Thiosildenafil

图4 硫代西地那非的特征裂解途径Fig.4 Characteristic fragmentation pathways of thiosildenafil

另外，质谱图上其余质谱峰均与推测结构相匹配。样品脱水后得到碎片离子m/z 517.3，并以砜基团O=S=O为中心发生异裂，苯环与嘧啶环一侧可得到碎片离子m/z 341.4和m/z 359.3，前者继续脱去C3H6，得到碎片离子m/z299.0，而后者继续脱去C3H8，得到碎片离子m/z315.2；哌嗪一侧得到碎片离子m/z 129.3，继而脱去CH2O，产生碎片离子m/z 99.2，再丢失碎片C2H3N，得到碎片离子m/z58.3。碎片离子m/z112.3是由m/z 129.3脱去 OH-自由基而得到的，继续脱去CH2N·后，产生碎片离子m/z58.3，样品具体质谱裂解过程见图6。由此推测，该样品结构为5-﹛5-［4-（2-羟乙基）哌嗪磺酰］-2-正丙氧基苯基﹜-1-甲基-3-正丙基-1H-吡啶并 ［4，3-d］嘧啶-7（6H）-硫酮，见图5。

图5 样品推测结构Fig.5 Possible structure of sample

3.3 核磁共振研究

3.3.1 氢谱研究 硫代西地那非结构和其原子编号分别见图3和图5，核磁数据见表2。在样品1H -1H COSY谱（图7）中，δ0.94（dt，6H，J= 7.4，11.0 Hz）与δ1.74（m，4H）之间存在邻位耦合，可推测其分别为-CH2CH3中的CH3与CH2。δ2.81（t，2H，J=7.5Hz）、δ4.14（t，2H，J= 6.5Hz）和δ1.74之间存在邻位耦合，H-29与O相连，化学位移增加，所以δ2.81和δ4.14分别为H-25和H-29。δ7～8之间的3个苯环信号峰δ 7.39（d，1H，J=8.9Hz）、δ7.84（dd，1H，J=2.4，8.8Hz）和δ7.91（d，1H，J=2.4Hz）分别为H-12、H-13和H-15。δ4.44（s，3H）为N上CH3，因为受到N的影响，故向高场方向移动。δ1.36（s，1H）为OH上氢。δ2.50（m，4H）与δ2.89（s，4H）之间存在邻位耦合，推测为哌嗪环上18、19、20、21位的8个氢。因为H-18，H-22靠近磺酰基，故化学位移向高场方向移动，因此δ2.50为H-19和H-21，而δ2.89为H-18和H-22。δ3.42（dd，2H，J=5.5，10.6Hz）与δ2.38（s，2H）之间存在邻位耦合，而且H-34与OH相邻，所以δ3.42为H-34，而δ2.38为H-33。δ3.32（s，2H）为水峰，与DMSO-d6中水峰的情况相符［18］。样品氢谱的具体归属情况见图8。

图6 样品质谱裂解过程Fig.6 Fragmentation pathways of sam ple

3.3.2 碳谱研究 碳谱中有22种不同化学环境的C，其中有1个被DMSO-d6的溶剂峰所掩盖，放大局部后可以观察到。其中，δ46.1和δ52.2分别存在2个C，所以碳谱显示样品共含有24个C，和氢谱推测吻合。在SP杂化的C中，C-18、C-19、C-21、C-22、C-24和C-33分别与N相连；C-29和C-34分别与氧相连；C-25、C-26、C-27、C-30和C-36分别与 C相连，故处于高场位置。因此，δ10.6、δ14.0、δ21.8、δ22.0和δ27.2分别为C-36、C-27、C-26、C-30和C25。低场位置依次是与N相连的6个C和与O相连的2个C，所以δ 39.3为C-24；δ46.1为C-18和C-22；δ52.2为C-19和C-21；δ58.6为C-33；δ59.7为C-34；δ 70.8为C-29。另外，处于化学位移最低场位置的是δ172.2，为C-1。剩下信号均能和氢谱推测吻合，样品碳谱的具体归属情况见图9。

表2 硫代西地那非与样品核磁数据Tab.2 NMR data of thiosildenafil and samples

图7 样品1H-1H COSY谱Fig.71H-1H COSY spectrum of sam p le

4 结论

图8 样品核磁共振氢谱Fig.81H-NM R spectrum of sam p le

图9 样品核磁共振碳谱Fig.913C-NMR spectrum of sample

从样品勃尔特胶囊中分离出西地那非类非法添加物，同时通过质谱和核磁共振技术确定其结构为5-﹛5-［4-（2-羟乙基）哌嗪磺酰］-2-正丙氧基苯基﹜-1-甲基-3-正丙基-1H-吡啶并［4，3-d］嘧啶-7（6H）-硫酮。该化合物鲜有报道，而且未见其药理和毒理方面的文献资料，因此尚不明确它对人体可能产生的潜在危害，需密切关注。

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Adulterated PDE5inhibitor separated and identified from healthy products of prom oting sexual enhancement

HUANG Guo-dong1， HUANG Yan-ting2， CHEN Lin1， LEIYi2*， ZHANG Rong1*
（1.College of Pharmacy，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2.Guangdong Institute for Food and Drug Control，Guangzhou 510180，China）

AIMTo purify and identify the adulterated PDE5in healthy products of promoting sexual enhancement，and to provide technical supportand related spectraldata for the supervision and inspection.METHODSThe separation and purification of the adulterated was performed using TLC（thin layer chromatography），CC（column chromatography）and HPLC（high performance liquid chromatography）.NMR（nuclearmagnetic resonance）and MS（mass spectrometer）were used for the determination of the chemical structure.RESULTSYellow needle crystal，whose purity was up to 97%，was obtained，and its structure was proved to be 5-﹛5-［4-（2-hydroxyethyl）piperazin）sulfonyl］-2-propoxyphenyl﹜-1-methyl-3-propyl-1H-pyrazolo［4，3-d］pyrimidine-7（6H）-thione.CONCLUSIONThe constituents obtained from Bulte Capsules are rarely reported，so we should pay close attention to it.

healthy productsofpromoting sexualenhancement；adulterated；PDE5inhibitor；isolatation and identification；5-﹛5-［4-（2-hydroxyethyl）piperazin）sulfonyl］-2-propoxyphenyl﹜-1-methyl-3-propyl-1H-pyrazolo［4，3-d］pyrimidine-7（6H）-thione

R284.1

：A

：1001-1528（2015）06-1249-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.020

2014-07-24

国家自然科学基金项目 （20903026）；广州市健康产品非法添加化学成分快速检测技术重点实验室项目 （2013）；广东省省级科技计划项目 “食品药品安全快速检测技术及配套仪器产业化应用 （2013B090200059）”

黄国栋 （1988—），男，硕士，研究方向为化合物鉴定及构效关系。Tel：13828472068，E-mail：hgd0924@163.com

*通信作者：张 荣（1978—），女，博士，教授，研究方向为食品药品检测。E-mail：zhangr_zju@hotmail.com雷 毅（1977—），男，博士，主任药师，研究方向为食品药品检测。E-mail：Leiy04@qq.com

该化合物鲜有报道，需密切关注。