H3N2 流感病毒冷适应株的无血清培养

郭 琦 耿兴良 龙云凤 杨 帆 宋绍辉 刘 婧 戴宗祥 姜述德 廖国阳

流感病毒是威胁人类健康的主要病原体之一。目前对于流感病毒的主要有效预防方法依然是接种流感疫苗［1］。流感减毒活疫苗能够以与自然状态下机体感染流感野毒株相同的机制引起机体产生长效的细胞免疫和体液免疫，使机体获得交叉免疫保护的同时不会产生较明显的感染症状［1～3］。鉴于鸡胚生产流感病毒疫苗存在很多不足之处，WHO 推荐使用Vero 细胞作为流感疫苗的生产介质［4～8］。Vero 细胞培养流感病毒时，需要添加TPCK-胰酶裂解HA0 后病毒才能感染细胞。Vero 细胞培养使用的血清所含的类淀粉蛋白P，是甲型流感病毒表面唾液酰化糖蛋白的抑制剂，可通过影响TPCK 活性进而影响病毒的产量，同时血清作为培养基组分也存在较多弊端［6，9～12］。而无血清培养，既可戒除血清对流感病毒产量的影响，又能使后期工艺纯化不受血清中复杂组分的左右［10，11，13］。故本实验对无血清条件下培养H3N2 流感病毒冷适应株的适宜条件进行了探索。

材料与方法

1.材料：无血清培养的Vero 细胞( SFM-Vero) 第140 代，甲型流感病毒冷适应株A/Yunnan/1/2005 Vca ( H3N2) ，均由中国医学科学院医学生物学研究所生物制品五室保存。TPCK-胰酶( Worthington 公司) ； BSA( 北京鼎国生物公司) ；DMEM/F12 和RPMI-1640 培养基( 美国Thermo 公司) ；MEM基础培养基由医学生物学研究所溶液组配制；带FITC 标记的兔抗山羊绿色荧光抗体( BD 公司) 。BeckmanG25 离心机( Beckman 公司) ；细胞培养瓶、血凝板( Nunc 公司) ；细胞培养箱( 宾德公司) ；H-7650 透射式电子显微镜( 日立公司) 。

2.实验方法：( 1) 冷适应株H3N2 对无血清Vero 细胞的感染性检测：使用SFM -Vero 细胞铺至细胞爬片。培养24h后接种病毒，设立阴性对照孔。先后加多聚甲醛溶液、Triton-100、甲醇及BSA 溶液。加羊抗H3N2 血清及FITC 标记兔抗羊抗体孵育后封片观察。( 2) 无血清培养流感病毒冷适应株H3N2 的条件优化：①接种病毒胞龄的选择：使用MTT法在波长490nm 处测定吸光度值( A) ，按照均数± 标准差(±s) 求出区间，剔除不在此区间的A490值，求得平均值后，绘制细胞生长曲线，根据曲线选取不同点接种病毒，确定适合流感病毒冷适应株增殖的适宜细胞胞龄［10］；②基础培养基的的选择：分别以DMEM/F12、1640、MEM∶ DMEM/F12(1∶1) 的混合液、MEM 为基础培养基培养病毒，每个条件做4 个平行，(25.0 ±0.5) ℃培养相同时间后收获病毒液，测定其血凝效价［14］；③pH 值对流感病毒产量的影响：使用DMEM/F12 配制病毒培养液，调整病毒培养液pH 分别为6.89、7.15、7.37、7.64、7.84、7.97 培养H3N2 流感病毒相同时间后测定血凝效价；④BSA-TPCK 胰酶添加量对流感病毒产量的影响： 以组合的方式向病毒培养液中添加不同含量的BSA 和TPCK 胰酶，培养相同时间后收获病毒并测定血凝效价；⑤病毒培养过程中TPCK 胰酶补加时间及补加量的优化： 分别在病毒培养的24、48、72、96h 补加TPCK 胰酶，每次均按照0.3、0.6、1.0、1.3μg/ml 的终浓度分别进行补加，培养相同时间后测定病毒血凝效价；⑥病毒接种量对其产量的影响：在之前优化的条件下，分别按照MOI 0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 的量接种流感病毒，培养相同时间后测定血凝效价，确定适宜接种量； ⑦病毒收获时间的确定：按优化出来的条件培养病毒，每隔12h 进行取样，测定病毒的血凝效价，绘制病毒大致的增殖曲线，并依此来进一步优化病毒的收获时间；⑧病毒完整性检测：使用电子显微镜对无血清培养的H3N2 流感病毒冷适应株进行形态观察，并与10%血清培养的病毒形态进行对比。

结 果

1.病毒侵染性实验： 免疫荧光实验显示，被流感病毒感染的细胞呈现出绿色荧光，阴性对照基本不显示荧光。说明H3N2 流感病毒冷适应株可以在无血清培养基培养的Vero 细胞中增殖( 图1) 。

图1 冷适应株H3N2 流感病毒在SFM-Vero细胞上的免疫荧光( ×100)

2.H3N2 流感病毒冷适应株培养条件的优化：(1) 细胞胞龄的选择： 依据生长曲线，分别在细胞培养的12、24、36、48h 接种流感病毒，培养相同时间后测定病毒血凝效价［11］。结果显示胞龄为36h 接种培养出来的病毒效价最高，为1∶256。( 表1) 。( 2) 基础培养基的选择： 以DMEM/F12 为基础培养基培养病毒时，病毒效价为1∶240 均比其他培养基高，确定DMEM/F12 为基础培养基( 表2) 。(3) 病毒培养液pH 值的确定：本实验表明，当培养液的pH 值呈现弱碱性即pH 值为7.15 ～7.64 时，培养出的病毒血凝效价最高为1∶240( 表3) 。( 4) BSA 和TPCK 胰酶添加量对流感病毒产量的影响：通过测定病毒收获液的血凝效价后发现，BSA 和TPCK 胰酶添加的终浓度均在0.8 ～1.2μg/ml，可达到1∶224( 表4) 。(5) TPCK胰酶补加量和补加时间对流感病毒产量的影响：病毒培养96h 后按照1μg/ml 终浓度补加TPCK 胰酶，病毒效价最高为1 ∶256，测定血凝效价结果( 表5) 。(6) 接种量对病毒产量的影响： 培养条件得到初步的优化以后，病毒的接种量也是影响病毒产量的一个重要因素。从培养结果看，流感病毒接种量在0.05 ～0.10MOI 时，病毒效价最高可达1∶256 且稳定。( 7)病毒收获时间的确定：绘制出病毒大致的增殖曲线如图3。确定病毒的收获时间为168h，血凝效价最高，为1∶256。(8) 病毒完整性检测：如图4 所示，无血清条件下培养出的流感病毒轮廓清晰，形态完整。与对照中10%血清培养的病毒相比，形态差异无统计学意义。

图2 细胞生长曲线

表1 不同胞龄的SFM-Vero 细胞接种H3N2 流感病毒后的平均血凝效价

表2 不同基础培养基对病毒效价的影响

表3 不同pH 值对病毒效价的影响

表4 TPCK 胰酶和BSA 添加量对病毒效价的影响

表5 不同时间补加不同量的TPCK 胰酶后的病毒效价

图3 病毒增殖曲线

图4 不同血清条件培养的H3N2 流感病毒的形态( ×15000)

讨 论

流感病毒减毒活疫苗能够引起机体持久而多样的免疫反应，为流感的预防提供了新思路［15］。目前主要使用流感病毒冷适应株，温敏株或是复制缺陷株作为减毒活疫苗备选株［16］。已上市的减毒活疫苗均是以鸡胚为介质生产的，而使用细胞生产减毒活疫苗仍在研发中。Vero 细胞培养流感病毒时，需添加TPCK 胰酶裂解流感病毒HA0 蛋白，促进流感病毒吸附在细胞表面，使其能够有效增殖［11］。常规细胞培养中残留的血清成分会影响TPCK 胰酶的活性，从而影响流感病毒的产量。无血清细胞培养技术无疑是流感病毒减毒活疫苗制备的最佳选择，美国百特公司亦使用该技术培养流感病毒。本研究对H3N2 流感病毒冷适应株的无血清培养条件进行优化。

免疫荧光实验显示H3N2 流感病毒冷适应株对无血清培养的Vero 细胞有感染性，为此对其无血清培养条件进行初步优化。细胞培养36h 后接种病毒，所得病毒效价较高，此时细胞刚生长成致密的单层，且细胞活力高，对流感病毒敏感。培养时间短于36h，细胞对TPCK 胰酶的耐受力较低；超过36h，由于胞龄过长，细胞对病毒的敏感度下降，最终均影响病毒产量。同时，实验优选出DMEM/F12 为病毒培养的基础培养基。病毒培养液的pH 值为7.15 ～7.64时既不影响细胞状态又不影响TPCK 胰酶活性，较适合病毒增殖。此外BSA 作为培养液中的重要成分可单独或与TPCK 胰酶共同影响病毒产量。当BSA 和TPCK 胰酶的添加终浓度均为0.8 ～1.2μg/ml 时，病毒效价较高。培养过程中由于培养液pH 值的变化，TPCK 胰酶的活性受到影响，病毒再次感染受限。病毒培养96h 后补加终浓度为1μg/ml 的TPCK 胰酶能得到较高效价的病毒。过早补加TPCK 胰酶，会影响细胞生长状态。

除培养条件外，病毒接种量也是影响病毒产量的重要因素。病毒的接种量低，不能完全感染细胞； 接种量太高，则会形成缺陷干扰颗粒( defective interfering particles，DIP)，影 响 病 毒 正 常 感 染［11］。接 种0.05 ～0.10 MOI 的病毒，培养168h 后收获病毒效价最高。病毒培养时间过短，病毒未完全从感染的细胞中释放，病毒产量较低；培养时间过长，病毒易降解。

综上所述，本研究在确认了H3N2 流感病毒冷适应株在无血清适应的Vero 细胞上的感染性后初步优化了其无血清培养的条件，为安全有效的流感减毒活疫苗的生产和研发提供了依据。

1 Lanthier PA，Huston GE，Moquin A，et al. Live attenuated influenza vaccine ( LAIV) impacts innate and adaptive immune responses［J］.Vaccine，2011，29(44) ： 7849 -7856

2 Barrett PN，Portsmouth D，Ehrlich HJ. Vero cell culture - derived pandemic influenza vaccines： preclinical and clinical development［J］. Expert Review of Vaccines，2013，12(4) ： 395 -413

3 Belshe R，Lee M-S，Walker RE，et al. Safety，immunogenicity and efficacy of intranasal，live attenuated influenza vaccine［J］. Expert Review of Vaccines，2004，3(6) ： 643 -654

4 Murakami S，Horimoto T，Ito M，et al. Enhanced growth of influenza vaccine seed viruses in vero cells mediated by broadening the optimal pH range for virus membrane fusion［J］. Journal of Virology，2012，86(3) ： 1405 -1410

5 Tree JA，Richardson C，Fooks AR，et al. Comparison of large-scale mammalian cell culture systems with egg culture for the production of influenza virus A vaccine strains［J］. Vaccine，2001，19(25 -26) ：3444 -3450

6 Hu AY，Tseng YF，Weng TC，et al. Production of inactivated influenza H5N1 vaccines from MDCK cells in serum - free medium［J］.PLoS One，2011，6(1) ： e14578

7 Kistner O，Barrett PN，Mundt W，et al. Development of a mammalian cell ( Vero) derived candidate influenza virus vaccine［J］. Vaccine，1998，16(9 -10) ： 960 -968

8 Organization WH. Cell culture as a substrate for the production of influenza vaccines： memorandum from a WHO meeting［J］. Bulletin of the World Health Organization ( WHO) ，1995，73(4) ： 431 -435

9 Job ER，Bottazzi B，Gilbertson B，et al. Serum amyloid P is a sialylated glycoprotein inhibitor of influenza A viruses［J］. PloS one，2013，8(3) ： e59623

10 耿兴良，戴宗祥，段盼盼，等. Vero 细胞培养流感病毒的低血清培养基的筛选［J］. 中国生物制品学杂志，2014，27( 5) ： 687 -690

11 刘铮，孙明波，高菁霞，等. 低血清培养Vero 细胞和流感病毒条件的优化［J］. 中国生物制品学杂志，2009，22(6) ： 593 -595

12 Butler M. Serum-free media： standardizing cell culture system［J］.Pharmaceutical Bioprocessing，2013，1(4) ： 315 -318

13 田石华，孙明波，张新文，等. 无血清微载体培养Vero 细胞和H1N1 流感病毒条件的优化［J］. 中国生物制品学杂志，2010，23(6) ： 639 -642

14 唐静，马磊，周芳烨，等. 流感病毒快速诊断试剂中HA 抗原热稳定性的研究［J］. 安徽农业科学，2012，40(16) ： 8935 -8936

15 Tlaxca JL，Ellis S，Remmele RL. Live attenuated and inactivated viral vaccine formulation and nasal delivery： potential and challenges［J］. Advanced Drug Delivery Reviews，2014：1 -23

16 Zheng D，Yi YL，Chen Z. Development of live-attenuated influenza vaccines against outbreaks of H5N1 influenza［J］. Viruses，2012，4(12) ： 3589 -3605