比色法测定大血藤中总黄酮含量及其清除DPPH自由基研究
2015-01-15王伟邹金美黄冰晴赵晓丹洪雅珍张国广
王伟+邹金美+黄冰晴+赵晓丹+洪雅珍+张国广
摘要：以中药材大血藤[Sargentodoxacuneata（Oliv.）Rehd.etWils]的乙醇提取物为对象，提出1种基于比色法的大血藤总黄酮测定方法，同时考察了提取物对DPPH自由基的清除能力。结果表明，以芸香苷为标准品的亚硝酸钠-硝酸铝显色法更适合大血藤提取物中总黄酮含量的测定，测定波长为510nm，芸香苷在0～0.5mg/mL范围内，质量浓度与吸光度呈良好的线性关系，平均加样回收率为99.3%，精密度、稳定性、重现性均理想；抗氧化活性试验结果表明大血藤提取物具有很强的清除DPPH自由基能力。
关键词：大血藤；总黄酮；紫外-可见分光光度法；抗氧化性；自由基
中图分类号：R284.2文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0356-03
中药大血藤是木通科植物大血藤[Sargentodoxacuneata（Oliv.）Rehd.etWils.]的干燥藤茎，具有清热解毒、活血、祛风止痛等功效，主治肠痈腹痛、热毒疮疡、经闭、跌扑肿痛、风湿痹病等症，主要产自湖北省、四川省、江西省、浙江省、江苏省、福建省等地。大血藤在不同地区名称不一，《中药大辞典》记录的别名有：血藤、过山龙、红藤、千年健、血竭、血通、大活血、活血藤等10多种[1]。研究表明，大血藤含有多种化学成分，包括黄酮类、酚类、有机酸、木脂素、三萜皂苷、蒽醌类、糖苷类等物质，具有抑菌、抗炎、抗病毒、抑制血小板聚集、增加冠脉血流量、抗心肌等功效[2-6]。黄酮类化合物具有较强的抗氧化、抗肿瘤、抗炎镇痛、抗病毒、保肝护肝、保护心血管系统、抑菌、抗衰老、提高免疫力等功效。大血藤中黄酮类化合物受到很多研究者的关注[7-13]。本研究以中药材大血藤的乙醇提取物为对象，提出一种基于比色法的大血藤总黄酮测定方法，同时考察了提取物对DPPH自由基的清除能力，旨在为开发利用大血藤资源提供依据。
1材料与方法
1.1材料
大血藤药材购于福建省漳州市某中药店。槲皮素与芸香苷标准品均购于中国食品药品检定研究院。DPPH购于梯希爱（上海）化成公司；无水乙醇、氯化铝、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、维生素C等药品均为分析纯试剂，购自国药集团化学试剂公司。RE52-99旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；AR124CN电子分析天平（美国奥豪斯公司）；超声波细胞破碎仪（宁波新芝生物科技有限公司）；UV-1750紫外可见光分光光度计（日本岛津公司）；MultiskanGO全波长酶标仪（美国Thermo公司）；ZWY-2102C全温摇床（上海智城分析仪器制造有限公司）；万能粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）。
1.2样品溶液的制备
用粉碎机将大血藤药材充分粉碎，准确称取药材粉末0.5g，置于烧杯中，加入60%乙醇50mL，封口后放入全温摇床120r/min60℃振荡浸提24h。浸提结束后超声破碎提取30min，超声破碎程序设定为超声15s，间歇15s，超声频率40Hz，功率1000W。超声结束后抽滤取过滤液，用60%乙醇定容至50mL，得到10g/L样品溶液。
1.3黄酮标准品溶液的配制
称取芸香苷、槲皮素标准品各5mg，分别置于50mL容量瓶中，加适量无水乙醇将其完全溶解，纯水定容，得到0.1mg/mL芸香苷标准液、槲皮素标准液。
1.4黄酮3种定量测定方法
1.4.1直接测定法分别取大血藤提取物溶液、芸香苷标准液、槲皮素标准液，用紫外分光光计在300～800nm波长范围内进行光谱扫描，60%乙醇作基线处理，记录吸光度。
1.4.2三氯化铝法分别取1mL大血藤提取物溶液、芸香苷标准液、槲皮素标准液，加入3支10mL具刻度试管中，依次加入1mL0.1mol/LAlCl3溶液及1mLpH值为5.5的醋酸钠-醋酸缓冲液，用60%乙醇定容至刻度，在300～800nm波长范围内进行光谱扫描，60%乙醇同样显色后作扫描基线，记录吸光度。
1.4.3亚硝酸钠-硝酸铝法分别取1mL大血藤提取物溶液、芸香苷标准液、槲皮素标准液，加入3支10mL具刻度试管中，加60%乙醇定容至5mL，加5%NaNO2溶液300μL，静置6min后加入10%Al（NO3）3溶液300μL，静置6min后再加入4mL1.0mol/LNaOH溶液，最后用60%乙醇定容至10mL，30℃水浴静置20min，在300～800nm波长范围内进行光谱扫描，60%乙醇加显色剂管作扫描基线，记录吸光度。
1.5亚硝酸钠-硝酸铝显色法考察
根据以上3种方法的光谱扫描结果，筛选出合适的标准品为芸香苷，采用亚硝酸钠-硝酸铝法显色进行试验。
1.5.1标准曲线绘制分别取芸香苷标准液0、1、2、3、4、5mL至6支10mL具刻度试管中，加60%乙醇稀释至5mL，按照“1.4.3”节的方法显色，在510nm波长处测定吸光度，以标准品质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
1.5.2精密度试验精确移取标准品液1mL，样品液1mL（5个平行样），按亚硝酸钠-硝酸铝显色法进行操作，测定510nm波长处吸光度，计算样品相对标准偏差（RSD）。
1.5.3稳定性试验将芸香苷标准品及样品按亚硝酸钠-硝酸铝法操作，每隔10min于510nm波长处测定1次吸光度，共测60min，计算样品测定值相对标准偏差（RSD）。
1.5.4重现性考察精确称取大血藤粉末4份，每份0.5g，按照“1.2”节方法制成大血藤提取液，按亚硝酸钠-硝酸铝法进行操作，于510nm波长处测定吸光度，计算4份大血藤提取物的总黄酮浓度，计算4份样品相对标准偏差（RSD）。
1.5.5加标回收率试验用移液管精确移取5mL样品液置于烧杯中，加入60%乙醇溶液稀释至20mL，精确吸取1mL稀释后的样品液置于3支10mL具刻度试管中，按照亚硝酸钠-硝酸铝法于510nm波长处测定吸光度，将吸光度代入标准曲线，求得1mL提取液中黄酮浓度，取平均值。另取4支干净试管，精密吸取1mL上述已测定黄酮浓度的样品液，分别加入1、2、3、4mL芸香苷标准液，按亚硝酸钠-硝酸铝法操作，于510nm波长处测定吸光度，计算加标回收率。endprint
1.6DPPH自由基清除能力测定
将大血藤样品母液分别配制成药材干质量浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1g/L的6个浓度梯度。取96孔酶标板，每6个测定孔为1组，依次加入不同浓度的大血藤提取物100μL，然后选其中1组分别加入100μL0.06mmol/LDPPH溶液，另外1组分别加入100μL无水乙醇作为对照组，混匀，室温下放置30min后，在全波长酶标仪中517nm波长下测定各孔的吸光度，加入DPPH组测定值为As，加入无水乙醇组测定值为At，同时设置100μL60%乙醇加100μLDPPH反应组，其吸光度作为空白对照Do，DPPH自由基清除率（I）计算公式如下。维生素C作为阳性对照。
2结果与分析
2.1光谱扫描结果
由图1可知，芸香苷在368nm波长处、槲皮素在336nm波长处有最大吸收峰，样品在434nm波长处有较大吸收峰，在近300nm波长处吸光度达到最大，该区间与标准品没有很好地重叠，且大血藤提取物肉眼观察呈现红色，因此在紫外区-近紫外区吸光度较大，且紫外区测定易受蒽醌、酚类物质的干扰，该方法不适合大血藤黄酮的定量测定。由图2可知，AlCl3显色体系中，槲皮素在430nm波长处、芸香苷在414nm波长处吸光度最大，大血藤样品在420nm波长附近并没有明显吸收峰，该方法不能用于大血藤黄酮的定量测定。由图3可知，在亚硝酸钠-硝酸铝显色体系中，芸香苷在510nm波长处吸光度最大，样品在502nm波长处吸光度最大，二者吻合度较高，槲皮素可见光区未观察到明显的吸收峰，所以本研究确定芸香苷为测定标准品，采用亚硝酸钠-硝酸铝显色方法，测定波长为510nm进行下一步试验。在该显色方法下，加入NaOH后，溶液中出现肉眼几乎难以察觉的细小悬浮物，长时间静置后变成沉淀析出，用滤纸将溶液过滤后进行测定，后续试验均需将测定溶液静置20min后用滤纸过滤后测定。
2.2标准曲线绘制
芸香苷标准品溶液的线性回归方程为y=1.2354x+0.0015，r=0.9998，线性范围为0～0.5g/L。
2.3精密度试验结果
由表1可知，芸香苷标准品溶液吸光度RSD为2.51%，样品溶液吸光度RSD为1.58%，精密度良好。
2.4稳定性试验结果
由表2可知，芸香苷标准品溶液吸光度RSD为0.26%，样品溶液吸光度RSD为2.28%，说明在60min内吸光度稳定性好。
2.5重现性试验结果
重现性考察结果表明，4次平行提取大血藤提取物中黄酮含量分别为0.580、0.570、0.602、0.562g/L，平均值为0.5785g/L，RSD为2.99%，重现性好。
2.6加标回收率试验结果
稀释后大血藤样品黄酮平均含量为0.150mg/mL，加标回收率在97.7%～101.0%，平均回收率为99.3%（表3），说明该法准确度高。
2.7大血藤DPPH自由基清除能力
由图4可知，随着大血藤提取物浓度和维生素C浓度的增大，DPPH自由基清除率均逐渐升高。
3结论与讨论
大血藤药材中黄酮种类较为复杂，有数十种[10]。目前，不同学者采用不同的方法对大血藤药材中总黄酮含量进行测定，有采用HPLC方法测定的[8]，有采用紫外法即低浓度氯化铝显色后在275nm处测定的[7]，有采用氯化铝显色后在420nm处测定的[9]，有采用亚硝酸钠-硝酸铝显色后在510nm处[13]测定的。本研究结果表明，大血藤乙醇提取物AlCl3显色后在420nm附近并没有明显的光吸收峰，直接在紫外光范围内测定易受大血藤中蒽醌类、酚类化合物干扰，且对样品制备条件及机器性能要求比较高，二者不适合用于大血藤黄酮的比色法定量，因此笔者选择了亚硝酸钠-硝酸铝显色法进行下一步试验。笔者在试验过程中发现，加入NaOH溶液后，会形成一些肉眼难以观察到的细小悬浮物，将溶液放置8h以上，在试管中能看到明显的沉淀物（同时进行的芸香苷标准液显色中未出现沉淀现象）。曾凡骏等用同样的方法测定银杏叶总黄酮时也观察到这种沉淀[14]。本试验将静置时间延长至20min，让原花色素类物质在碱性条件下充分沉淀，取滤纸过滤溶液用于测定，60min内吸光度稳定性很好。大血藤黄酮类化合物组成比较复杂，药材来源、提取工艺、测定方法、标准品选择等诸多因素对测定结果均有较大影响。本研究中基于分光光度计的亚硝酸钠-硝酸铝显色法的精密度、稳定性、重现性、线性关系、加标回收率均较高。DPPH在有机溶剂中是1种较稳定的自由基，在517nm波长处有强吸收，其结构中1个氮原子上有1个孤对电子，当自由基清除剂存在时，该孤对单电子被配对而导致其颜色变浅，而且这种颜色变浅的程度与配对电子数呈化学剂量关系，因此DPPH被广泛用于检测自由基的清除情况以及评价样品的抗氧化能力。大血藤乙醇提取物具有很强的DPPH自由基清除能力。
参考文献：
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[6]李钧敏，陈永辉，金则新，等.大血藤黄酮类化合物的提取与分析[J].武汉植物学研究，2002，20（2）：157-161.
[7]葛明菊，李钧敏，张利龙，等.大血藤叶片黄酮类化合物的HPLC分析[J].浙江中医学院学报，2002，26（6）：71-72.
[8]李钧敏，金则新，钟章成，等.大血藤不同器官黄酮类化合物含量的季节变化[J].植物资源与环境学报，2002，11（1）：57-58.
[9]葛明菊，金则新，李钧敏，等.大血藤黄酮类化合物组成的初步研究[J].浙江林学院学报，2002，19（4）：382-386.
[10]邵红，李钧敏，金则新.不同产地大血藤次生代谢产物含量比较[J].植物研究，2006，26（3）：342-348.
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[12]韩磊，邓翀，张萌，等.正交试验设计优化大血藤总黄酮提取工艺[J].陕西中医学院学报，2012，35（5）：90-91.
[13]韩伟，叶亚婧，葛珊珊，等.吐温60与纤维素酶协同超声波法提取红藤中总黄酮的工艺[J].南京工业大学学报：自然科学版，2012，34（6）：63-68.
[14]曾凡骏，陈松波，曾里，等.一种改进的银杏黄酮紫外分光光度检测方法的研究[J].食品科学，2003，24（11）：102-104.endprint
1.6DPPH自由基清除能力测定
将大血藤样品母液分别配制成药材干质量浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1g/L的6个浓度梯度。取96孔酶标板，每6个测定孔为1组，依次加入不同浓度的大血藤提取物100μL，然后选其中1组分别加入100μL0.06mmol/LDPPH溶液，另外1组分别加入100μL无水乙醇作为对照组，混匀，室温下放置30min后，在全波长酶标仪中517nm波长下测定各孔的吸光度，加入DPPH组测定值为As，加入无水乙醇组测定值为At，同时设置100μL60%乙醇加100μLDPPH反应组，其吸光度作为空白对照Do，DPPH自由基清除率（I）计算公式如下。维生素C作为阳性对照。
2结果与分析
2.1光谱扫描结果
由图1可知，芸香苷在368nm波长处、槲皮素在336nm波长处有最大吸收峰，样品在434nm波长处有较大吸收峰，在近300nm波长处吸光度达到最大，该区间与标准品没有很好地重叠，且大血藤提取物肉眼观察呈现红色，因此在紫外区-近紫外区吸光度较大，且紫外区测定易受蒽醌、酚类物质的干扰，该方法不适合大血藤黄酮的定量测定。由图2可知，AlCl3显色体系中，槲皮素在430nm波长处、芸香苷在414nm波长处吸光度最大，大血藤样品在420nm波长附近并没有明显吸收峰，该方法不能用于大血藤黄酮的定量测定。由图3可知，在亚硝酸钠-硝酸铝显色体系中，芸香苷在510nm波长处吸光度最大，样品在502nm波长处吸光度最大，二者吻合度较高，槲皮素可见光区未观察到明显的吸收峰，所以本研究确定芸香苷为测定标准品，采用亚硝酸钠-硝酸铝显色方法，测定波长为510nm进行下一步试验。在该显色方法下，加入NaOH后，溶液中出现肉眼几乎难以察觉的细小悬浮物，长时间静置后变成沉淀析出，用滤纸将溶液过滤后进行测定，后续试验均需将测定溶液静置20min后用滤纸过滤后测定。
2.2标准曲线绘制
芸香苷标准品溶液的线性回归方程为y=1.2354x+0.0015，r=0.9998，线性范围为0～0.5g/L。
2.3精密度试验结果
由表1可知，芸香苷标准品溶液吸光度RSD为2.51%，样品溶液吸光度RSD为1.58%，精密度良好。
2.4稳定性试验结果
由表2可知，芸香苷标准品溶液吸光度RSD为0.26%，样品溶液吸光度RSD为2.28%，说明在60min内吸光度稳定性好。
2.5重现性试验结果
重现性考察结果表明，4次平行提取大血藤提取物中黄酮含量分别为0.580、0.570、0.602、0.562g/L，平均值为0.5785g/L，RSD为2.99%，重现性好。
2.6加标回收率试验结果
稀释后大血藤样品黄酮平均含量为0.150mg/mL，加标回收率在97.7%～101.0%，平均回收率为99.3%（表3），说明该法准确度高。
2.7大血藤DPPH自由基清除能力
由图4可知，随着大血藤提取物浓度和维生素C浓度的增大，DPPH自由基清除率均逐渐升高。
3结论与讨论
大血藤药材中黄酮种类较为复杂，有数十种[10]。目前，不同学者采用不同的方法对大血藤药材中总黄酮含量进行测定，有采用HPLC方法测定的[8]，有采用紫外法即低浓度氯化铝显色后在275nm处测定的[7]，有采用氯化铝显色后在420nm处测定的[9]，有采用亚硝酸钠-硝酸铝显色后在510nm处[13]测定的。本研究结果表明，大血藤乙醇提取物AlCl3显色后在420nm附近并没有明显的光吸收峰，直接在紫外光范围内测定易受大血藤中蒽醌类、酚类化合物干扰，且对样品制备条件及机器性能要求比较高，二者不适合用于大血藤黄酮的比色法定量，因此笔者选择了亚硝酸钠-硝酸铝显色法进行下一步试验。笔者在试验过程中发现，加入NaOH溶液后，会形成一些肉眼难以观察到的细小悬浮物，将溶液放置8h以上，在试管中能看到明显的沉淀物（同时进行的芸香苷标准液显色中未出现沉淀现象）。曾凡骏等用同样的方法测定银杏叶总黄酮时也观察到这种沉淀[14]。本试验将静置时间延长至20min，让原花色素类物质在碱性条件下充分沉淀，取滤纸过滤溶液用于测定，60min内吸光度稳定性很好。大血藤黄酮类化合物组成比较复杂，药材来源、提取工艺、测定方法、标准品选择等诸多因素对测定结果均有较大影响。本研究中基于分光光度计的亚硝酸钠-硝酸铝显色法的精密度、稳定性、重现性、线性关系、加标回收率均较高。DPPH在有机溶剂中是1种较稳定的自由基，在517nm波长处有强吸收，其结构中1个氮原子上有1个孤对电子，当自由基清除剂存在时，该孤对单电子被配对而导致其颜色变浅，而且这种颜色变浅的程度与配对电子数呈化学剂量关系，因此DPPH被广泛用于检测自由基的清除情况以及评价样品的抗氧化能力。大血藤乙醇提取物具有很强的DPPH自由基清除能力。
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[8]李钧敏，金则新，钟章成，等.大血藤不同器官黄酮类化合物含量的季节变化[J].植物资源与环境学报，2002，11（1）：57-58.
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[10]邵红，李钧敏，金则新.不同产地大血藤次生代谢产物含量比较[J].植物研究，2006，26（3）：342-348.
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[14]曾凡骏，陈松波，曾里，等.一种改进的银杏黄酮紫外分光光度检测方法的研究[J].食品科学，2003，24（11）：102-104.endprint
1.6DPPH自由基清除能力测定
将大血藤样品母液分别配制成药材干质量浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1g/L的6个浓度梯度。取96孔酶标板，每6个测定孔为1组，依次加入不同浓度的大血藤提取物100μL，然后选其中1组分别加入100μL0.06mmol/LDPPH溶液，另外1组分别加入100μL无水乙醇作为对照组，混匀，室温下放置30min后，在全波长酶标仪中517nm波长下测定各孔的吸光度，加入DPPH组测定值为As，加入无水乙醇组测定值为At，同时设置100μL60%乙醇加100μLDPPH反应组，其吸光度作为空白对照Do，DPPH自由基清除率（I）计算公式如下。维生素C作为阳性对照。
2结果与分析
2.1光谱扫描结果
由图1可知，芸香苷在368nm波长处、槲皮素在336nm波长处有最大吸收峰，样品在434nm波长处有较大吸收峰，在近300nm波长处吸光度达到最大，该区间与标准品没有很好地重叠，且大血藤提取物肉眼观察呈现红色，因此在紫外区-近紫外区吸光度较大，且紫外区测定易受蒽醌、酚类物质的干扰，该方法不适合大血藤黄酮的定量测定。由图2可知，AlCl3显色体系中，槲皮素在430nm波长处、芸香苷在414nm波长处吸光度最大，大血藤样品在420nm波长附近并没有明显吸收峰，该方法不能用于大血藤黄酮的定量测定。由图3可知，在亚硝酸钠-硝酸铝显色体系中，芸香苷在510nm波长处吸光度最大，样品在502nm波长处吸光度最大，二者吻合度较高，槲皮素可见光区未观察到明显的吸收峰，所以本研究确定芸香苷为测定标准品，采用亚硝酸钠-硝酸铝显色方法，测定波长为510nm进行下一步试验。在该显色方法下，加入NaOH后，溶液中出现肉眼几乎难以察觉的细小悬浮物，长时间静置后变成沉淀析出，用滤纸将溶液过滤后进行测定，后续试验均需将测定溶液静置20min后用滤纸过滤后测定。
2.2标准曲线绘制
芸香苷标准品溶液的线性回归方程为y=1.2354x+0.0015，r=0.9998，线性范围为0～0.5g/L。
2.3精密度试验结果
由表1可知，芸香苷标准品溶液吸光度RSD为2.51%，样品溶液吸光度RSD为1.58%，精密度良好。
2.4稳定性试验结果
由表2可知，芸香苷标准品溶液吸光度RSD为0.26%，样品溶液吸光度RSD为2.28%，说明在60min内吸光度稳定性好。
2.5重现性试验结果
重现性考察结果表明，4次平行提取大血藤提取物中黄酮含量分别为0.580、0.570、0.602、0.562g/L，平均值为0.5785g/L，RSD为2.99%，重现性好。
2.6加标回收率试验结果
稀释后大血藤样品黄酮平均含量为0.150mg/mL，加标回收率在97.7%～101.0%，平均回收率为99.3%（表3），说明该法准确度高。
2.7大血藤DPPH自由基清除能力
由图4可知，随着大血藤提取物浓度和维生素C浓度的增大，DPPH自由基清除率均逐渐升高。
3结论与讨论
大血藤药材中黄酮种类较为复杂，有数十种[10]。目前，不同学者采用不同的方法对大血藤药材中总黄酮含量进行测定，有采用HPLC方法测定的[8]，有采用紫外法即低浓度氯化铝显色后在275nm处测定的[7]，有采用氯化铝显色后在420nm处测定的[9]，有采用亚硝酸钠-硝酸铝显色后在510nm处[13]测定的。本研究结果表明，大血藤乙醇提取物AlCl3显色后在420nm附近并没有明显的光吸收峰，直接在紫外光范围内测定易受大血藤中蒽醌类、酚类化合物干扰，且对样品制备条件及机器性能要求比较高，二者不适合用于大血藤黄酮的比色法定量，因此笔者选择了亚硝酸钠-硝酸铝显色法进行下一步试验。笔者在试验过程中发现，加入NaOH溶液后，会形成一些肉眼难以观察到的细小悬浮物，将溶液放置8h以上，在试管中能看到明显的沉淀物（同时进行的芸香苷标准液显色中未出现沉淀现象）。曾凡骏等用同样的方法测定银杏叶总黄酮时也观察到这种沉淀[14]。本试验将静置时间延长至20min，让原花色素类物质在碱性条件下充分沉淀，取滤纸过滤溶液用于测定，60min内吸光度稳定性很好。大血藤黄酮类化合物组成比较复杂，药材来源、提取工艺、测定方法、标准品选择等诸多因素对测定结果均有较大影响。本研究中基于分光光度计的亚硝酸钠-硝酸铝显色法的精密度、稳定性、重现性、线性关系、加标回收率均较高。DPPH在有机溶剂中是1种较稳定的自由基，在517nm波长处有强吸收，其结构中1个氮原子上有1个孤对电子，当自由基清除剂存在时，该孤对单电子被配对而导致其颜色变浅，而且这种颜色变浅的程度与配对电子数呈化学剂量关系，因此DPPH被广泛用于检测自由基的清除情况以及评价样品的抗氧化能力。大血藤乙醇提取物具有很强的DPPH自由基清除能力。
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