铁皮石斛离体快繁技术

余乐+兰芹英+姜宗庆

摘要：以铁皮石斛（DendrobiumofficinaleKimuraetMigo）为研究对象，通过对不同无机盐浓度、不同培养温度以及不同激素浓度配比等影响因子进行研究，确立以种子无菌萌发为途径的铁皮石斛组培快繁体系。结果表明：25℃时，1/2MS+2mg/L6-BA+0.1mg/LNAA培养基配方最有利于铁皮石斛原球茎的诱导和幼苗分化；1/2MS+0.5mg/LNAA培养基配方最适合铁皮石斛幼苗生根，生根率达100%。

关键词：铁皮石斛；种子；离体快繁；优化培养基配方

中图分类号：S567.23+9.04文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0268-02

铁皮石斛（DendrobiumofficinaleKimuraetMigo）为兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium）多年生附生型草本植物，别称黑节草、铁皮兰，是我国特有的名贵药材[1-3]。此外，铁皮石斛亦有“救命仙草”“寸金草”之称[4]，《道臧》将其誉为“中华九大仙草之首”。近年来，由于人们对石斛生存环境的过度破坏，野生石斛长期处于被滥采滥挖的状态；加上石斛自然繁殖困难，种子萌发率低，而传统繁殖又较为缓慢，现在已经很难发现野生铁皮石斛的踪迹[5-10]，因而药用石斛市场供需矛盾也就日益凸显出来[11-12]。本研究以铁皮石斛成熟种子为外植体，通过对不同无机盐浓度、不同培养温度以及不同激素浓度配比等问题的探讨，以期建立铁皮石斛离体快繁技术体系，从而为铁皮石斛工厂化生产提供理论依据与技术指导，对野生石斛的种质资源保护也具有重要意义。

1材料与方法

1.1试验材料

试验用铁皮石斛成熟种子由泰州森禾花卉园艺有限公司花木基地提供。

1.2试验方法

1.2.1种子无菌萌发（1）培养基种类对种子萌发的影响试验：设KC、1/2MS、1/4MS、MS等4种培养基，均添加2%蔗糖、0.6%琼脂、20%马铃薯汁，调节pH值为5.6～5.8，培养温度为25℃，光照度2000lx，光照时间12h/d，环境湿度60%～70%。（2）培养温度对种子萌发的影响试验：设15～30℃和25/30℃变温处理，培养基配方为1/2MS+2%蔗糖+0.6%琼脂+20%马铃薯汁，pH值5.6～5.8，培养温度为（25±1）℃，光照度为2000lx，光照时间为12h/d，环境湿度60%～70%。12瓶为1组，每组3个重复，30d为1个周期，观察并统计种子萌发、原球茎的生长情况，选出最适宜铁皮石斛种子无菌萌发的基础培养基。

1.2.2原球茎增殖与分化研究不同激素浓度配比对铁皮石斛原球茎增殖与分化的影响，培养基配方为：MS+1～3mg/L6-BA+0.1～0.5mg/LNAA+2%蔗糖+0.6%琼脂+20%马铃薯汁。调节pH值至5.6～5.8，放置于（25±1）℃、光照度2000lx，光照时间12h/d、环境湿度60%～70%的条件下培养。12瓶为1组，每组3个重复，60d为1个周期，观察并统计原球茎增殖与分化情况，从中选出最适宜铁皮石斛原球茎增殖与分化的培养基。

1.2.3幼苗壮苗生根培养将生长良好的铁皮石斛组培苗接入配方为MS+0.1～1.0mg/LNAA+2%蔗糖+0.6%琼脂+20%马铃薯汁的培养基中。调节pH值为5.6～5.8，放置于（25±1）℃、光照度2000lx、光照时间12h/d、环境湿度60%～70%的条件下培养。12瓶为1组，每组3个重复，60d为1个周期，观察并统计铁皮石斛幼苗壮苗的生根情况，筛选出适合铁皮石斛幼苗壮苗生根培养的培养基。

1.2.4炼苗移栽将生长良好、根系发达的铁皮石斛组培苗于常温下炼苗3～5d后移栽至日光温室中。培养温度为（23±2）℃，环境湿度70%～80%。栽培基质为泥炭土、碎树皮，栽培容器为无纺布袋、塑料花盆。以50株苗为1组，每组3个重复，60d为1个周期，筛选出适合铁皮石斛组培苗的栽培环境。

2结果与分析

2.1种子无菌萌发

2.1.1基本培养基的筛选由表1可以看出，铁皮石斛种子在4种基本培养基中均能萌发，但原球茎诱导效果存在差异。以1/2MS最好，1/4MS次之，MS的诱导效果最差；铁皮石斛种子在1/2MS培养基上的萌发时间较短，且萌发整齐，原球茎诱导率高达91.1%。实际观察发现，1/2MS培养基上的原球茎呈鲜绿色，且粒大。综合考虑原球茎的诱导率和生长势，1/2MS培养基是最适合铁皮石斛种子无菌萌发的基础培养基。

2.1.2温度对种子萌发的影响由表2可以看出，在15℃培养30d后，铁皮石斛种子没有发生变化；在20℃条件下培养的种子，原球茎体积较小，呈嫩绿色，诱导时间比25℃、30℃和25/30℃变温培养条件的长；25℃条件下的种子萌发整齐一致，原球茎呈绿色，且粒大。综上分析可知，25℃较适合铁皮石斛种子的无菌萌发。

2.2原球茎增殖与分化

植物生长调节剂是培养基中的关键物质，在铁皮石斛组培快繁过程中作用明显。将种子萌发后诱导出的原球茎接入培养基中，60d后观察统计。表3结果表明，即使不添加任何激素，原球茎也能增殖，但增殖系数最低，增殖情况最差；适当浓度的激素配比有利于原球茎的增殖，以添加1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA激素浓度组合的增殖效果最好，增殖系数达到10.2，原球茎呈绿色，簇生，增殖趋势明显。

将已增殖的原球茎接入到诱导分化的培养基中，60d后观察。表3结果表明，以添加2.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA激素浓度组合的分化效果最好，分化出的幼苗已有细根，且仍有分化趋势，分化率可达80.5%。

综合表3试验结果可知，0.1mg/LNAA对原球茎增殖的效果较好，当浓度升高到0.5mg/L时，增殖效果会受到抑制；2.0mg/L6-BA最有利于原球茎分化，当浓度升高或降低时，原球茎分化效果均受到抑制。endprint

2.3试管苗生根培养

由表4可以看出，添加不同浓度NAA对铁皮石斛试管苗生根影响较大：在不添加NAA的情况下，铁皮石斛苗生根率仅为30.5%，平均根数2.6条，平均根长1.9cm，铁皮石斛苗长势一般；当NAA浓度为0.5mg/L时，生根效果最好，生根率为100%，平均根数6.6条，平均根长4.9cm，根系粗壮，根上伴有少许白色刚毛，苗长势快。总的结果表明：0.5mg/LNAA的生根效果要优于0.1mg/L和1.0mg/LNAA这2个处理，可见适当浓度的NAA有利于铁皮石斛苗的生根。

2.4炼苗移栽

铁皮石斛属附生兰，根为气生根，对生境要求比较苛刻，因此栽培基质及栽培容器的选择对移栽成活与否至关重要。由表5可以看出，碎树皮+无纺布袋组合的试管苗移栽成活率最高，为91.0%；其次为碎树皮+塑料花盆组合，成活率为77.6%；而泥炭土+塑料花盆组合效果最差，成活率仅为8.9%，且实际观察多有烂根现象。因此试验中较为理想的组合为碎树皮+无纺布袋，究其原因，是以碎树皮为基质、无纺布袋作为栽培容器时，通气且排水性良好，不会导致铁皮石斛烂根，因此生长状态最佳。

3讨论

铁皮石斛种子极为细小，蒴果内种子数以万计，但其种子多为败育，需与特定的真菌共生才能出芽，萌发率极低，一般低于5%[4]。研究表明：25℃是铁皮石斛的最适培养温度，最适合种子无菌萌发的培养基为1/2MS基础培养基；铁皮石斛原球茎诱导和幼苗分化的最适激素组合是1/2MS+2mg/L6-BA+0.1mg/LNAA，增殖系数为8.7，分化率可达80.5%；1/2MS+0.5mg/LNAA培养基对铁皮石斛幼苗生根效果最好，根系发达，苗长势快，生根率达100%；铁皮石斛苗移栽宜用碎树皮作为基质，更接近其原生境；为确保铁皮石斛不烂根，以无纺布袋作为栽培容器，通气排水好，铁皮石斛苗生长健壮。铁皮石斛离体快繁技术体系的建立可以有效缓解石斛市场供需矛盾，为铁皮石斛种质资源保护与可持续利用提供了依据。

参考文献：

[1]吴菊，严中琪，杨飞，等.铁皮石斛组培快繁关键技术研究[J].浙江农业科学，2014（4）：492-497.

[2]吴慧凤，宋希强，刘红霞.铁皮石斛种子的室内共生萌发[J].生态学报，2012，32（8）：2491-2497.

[3]杨明志，顺庆生，中华石斛丛书编辑部.中国药用石斛标准研究与应用[M].成都：四川科学技术出版社，2012：3-15.

[4]张志勇.铁皮石斛人工杂交育种快繁技术[J].福建农业科技，2011，6（6）：88-90.

[5]王亚妮，王丽琨，苗宗保，等.兰科石斛属植物菌根真菌研究进展[J].热带亚热带植物学报，2013，21（3）：281-288.

[6]孙江山，张传博，乙引，等.石斛属植物内生真菌研究进展[J].江苏农业科学，2012，40（6）：348-351.

[7]蒙平，张向军，蒋慧萍，等.铁皮石斛组培苗规模化驯化技术[J].农技服务，2009，26（1）：120-122.

[8]邹娜，喻苏琴，王春玲，等.铁皮石斛组织培养及试管开花研究[J].江苏农业科学，2013，41（12）：42-44.

[9]徐忠传，倪歆晨，蔡国超，等.不同光质条件下磁场处理对铁皮石斛原球茎生长的影响[J].江苏农业科学，2013，41（12）：254-256.

[10]潘梅，吕德任，姜殿强，等.铁皮石斛袋式组培快繁技术研究[J].江苏农业科学，2013，41（10）：37-40.

[11]何俊平，涂小云.不同培养基配方对铁皮石斛生根培养的影响[J].江苏农业科学，2013，41（2）：57-59.

[12]林伟强，边红武，王君晖，等.铁皮石斛类原球茎空气干燥法超低温保存中的脱水蛋白分析[J].园艺学报，2004，31（1）：64-68.endprint

2.3试管苗生根培养

由表4可以看出，添加不同浓度NAA对铁皮石斛试管苗生根影响较大：在不添加NAA的情况下，铁皮石斛苗生根率仅为30.5%，平均根数2.6条，平均根长1.9cm，铁皮石斛苗长势一般；当NAA浓度为0.5mg/L时，生根效果最好，生根率为100%，平均根数6.6条，平均根长4.9cm，根系粗壮，根上伴有少许白色刚毛，苗长势快。总的结果表明：0.5mg/LNAA的生根效果要优于0.1mg/L和1.0mg/LNAA这2个处理，可见适当浓度的NAA有利于铁皮石斛苗的生根。

2.4炼苗移栽

铁皮石斛属附生兰，根为气生根，对生境要求比较苛刻，因此栽培基质及栽培容器的选择对移栽成活与否至关重要。由表5可以看出，碎树皮+无纺布袋组合的试管苗移栽成活率最高，为91.0%；其次为碎树皮+塑料花盆组合，成活率为77.6%；而泥炭土+塑料花盆组合效果最差，成活率仅为8.9%，且实际观察多有烂根现象。因此试验中较为理想的组合为碎树皮+无纺布袋，究其原因，是以碎树皮为基质、无纺布袋作为栽培容器时，通气且排水性良好，不会导致铁皮石斛烂根，因此生长状态最佳。

3讨论

铁皮石斛种子极为细小，蒴果内种子数以万计，但其种子多为败育，需与特定的真菌共生才能出芽，萌发率极低，一般低于5%[4]。研究表明：25℃是铁皮石斛的最适培养温度，最适合种子无菌萌发的培养基为1/2MS基础培养基；铁皮石斛原球茎诱导和幼苗分化的最适激素组合是1/2MS+2mg/L6-BA+0.1mg/LNAA，增殖系数为8.7，分化率可达80.5%；1/2MS+0.5mg/LNAA培养基对铁皮石斛幼苗生根效果最好，根系发达，苗长势快，生根率达100%；铁皮石斛苗移栽宜用碎树皮作为基质，更接近其原生境；为确保铁皮石斛不烂根，以无纺布袋作为栽培容器，通气排水好，铁皮石斛苗生长健壮。铁皮石斛离体快繁技术体系的建立可以有效缓解石斛市场供需矛盾，为铁皮石斛种质资源保护与可持续利用提供了依据。

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[10]潘梅，吕德任，姜殿强，等.铁皮石斛袋式组培快繁技术研究[J].江苏农业科学，2013，41（10）：37-40.

[11]何俊平，涂小云.不同培养基配方对铁皮石斛生根培养的影响[J].江苏农业科学，2013，41（2）：57-59.

[12]林伟强，边红武，王君晖，等.铁皮石斛类原球茎空气干燥法超低温保存中的脱水蛋白分析[J].园艺学报，2004，31（1）：64-68.endprint

2.3试管苗生根培养

由表4可以看出，添加不同浓度NAA对铁皮石斛试管苗生根影响较大：在不添加NAA的情况下，铁皮石斛苗生根率仅为30.5%，平均根数2.6条，平均根长1.9cm，铁皮石斛苗长势一般；当NAA浓度为0.5mg/L时，生根效果最好，生根率为100%，平均根数6.6条，平均根长4.9cm，根系粗壮，根上伴有少许白色刚毛，苗长势快。总的结果表明：0.5mg/LNAA的生根效果要优于0.1mg/L和1.0mg/LNAA这2个处理，可见适当浓度的NAA有利于铁皮石斛苗的生根。

2.4炼苗移栽

铁皮石斛属附生兰，根为气生根，对生境要求比较苛刻，因此栽培基质及栽培容器的选择对移栽成活与否至关重要。由表5可以看出，碎树皮+无纺布袋组合的试管苗移栽成活率最高，为91.0%；其次为碎树皮+塑料花盆组合，成活率为77.6%；而泥炭土+塑料花盆组合效果最差，成活率仅为8.9%，且实际观察多有烂根现象。因此试验中较为理想的组合为碎树皮+无纺布袋，究其原因，是以碎树皮为基质、无纺布袋作为栽培容器时，通气且排水性良好，不会导致铁皮石斛烂根，因此生长状态最佳。

3讨论

铁皮石斛种子极为细小，蒴果内种子数以万计，但其种子多为败育，需与特定的真菌共生才能出芽，萌发率极低，一般低于5%[4]。研究表明：25℃是铁皮石斛的最适培养温度，最适合种子无菌萌发的培养基为1/2MS基础培养基；铁皮石斛原球茎诱导和幼苗分化的最适激素组合是1/2MS+2mg/L6-BA+0.1mg/LNAA，增殖系数为8.7，分化率可达80.5%；1/2MS+0.5mg/LNAA培养基对铁皮石斛幼苗生根效果最好，根系发达，苗长势快，生根率达100%；铁皮石斛苗移栽宜用碎树皮作为基质，更接近其原生境；为确保铁皮石斛不烂根，以无纺布袋作为栽培容器，通气排水好，铁皮石斛苗生长健壮。铁皮石斛离体快繁技术体系的建立可以有效缓解石斛市场供需矛盾，为铁皮石斛种质资源保护与可持续利用提供了依据。

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[10]潘梅，吕德任，姜殿强，等.铁皮石斛袋式组培快繁技术研究[J].江苏农业科学，2013，41（10）：37-40.

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[12]林伟强，边红武，王君晖，等.铁皮石斛类原球茎空气干燥法超低温保存中的脱水蛋白分析[J].园艺学报，2004，31（1）：64-68.endprint