猪细小病毒种子批中污染的猪鼻支原体的清除

郭龙飞+燕贺+杨霞+高东生+陈陆+常洪涛+王新卫+赵军+王川庆

摘要：支原体是细胞和病毒培养中常见的污染物，本研究尝试使用滤膜过滤法、反复多次冻融法、支原体抑制药物M-plasmocin处理法、氯仿抽提法等4种方法清除猪细小病毒种子批中污染的猪鼻支原体，并对4种方法的清除效果进行比较。结果表明，支原体抑制药物M-plasmocin处理法与氯仿抽提法效果较好，支原体抑制药物处理84h以及氯仿与被支原体污染的猪细小病毒液作用5min均能彻底清除猪细小病毒种子批中污染的支原体。本研究筛选出的清除猪细小病毒中支原体方法为非囊膜类病毒种子批中支原体的清除提供了依据。

关键词：种子批；支原体；猪细小病毒；氯仿；M-plasmocin

中图分类号：S852.65文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0222-03

生物制品是控制传染病的有效工具。病毒种子批是制造生物制品的基础，其直接关系到生物制品的质量。许多需要借助体外细胞培养增殖的病毒常因载体细胞受到支原体污染而被污染，致使生物制品报废[1]。支原体（Mycoplasma）是大小介于细菌和病毒之间的一类无细胞壁的原核细胞微生物，一般过滤除菌方法无法去除，因此支原体污染一般难于消除，约有30%～50%的细胞培养物中有支原体污染[2]。国内外研究结果表明，细胞培养中主要有口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体、发酵支原体、梨支原体和莱氏无胆甾原体等支原体污染[3-5]。支原体污染会导致细胞生长缓慢，从而影响需要借助细胞培养的病毒增殖，病毒种子批的建立，疫苗和相关生物制品的生产。

被支原体污染有的病毒种子批接种细胞后，支原体多吸附于细胞表面或散在细胞之间，通过竞争营养和分泌有毒代谢产物影响细胞的生理特性，常会误以为是病毒繁殖造成的病变效应，使研究结果的真实性和可靠性大大下降[6]。利用被支原体污染的细胞增殖病毒时会干扰病毒的复制、影响病毒滴度[7]，进而影响疫苗的免疫效果，并可导致免疫抑制[8]。细胞、病毒种子批、血清等的支原体污染均给科研、疫苗生产及生物制品产业带来很多麻烦，甚至造成事故。我国药典三部和欧洲药典都明确提出要对生物制品生产用细胞基质、病毒种子批、病毒收获液和细胞建库所用胰酶进行支原体检测[9-10]，以确保生物制品的质量。

迄今已报道多种方法被用于去除或减少培养细胞中污染的支原体，这些方法包括化学介质克隆法、特异性血清处理法[11]、巨噬细胞吞噬法、抗生素处理方法等[12-13]，但这些方法存在效果不好和耗时长及成本高等缺点。

猪细小病毒引起猪繁殖障碍性疾病，其特征是感染母猪，使初产母猪产出死胎、畸形胎、木乃伊胎、流产及病弱仔猪，给养猪业造成巨大的经济损失，目前对该病的防治主要通过给易感动物接种猪细小病毒灭活疫苗为主，制备疫苗的病毒质量直接关系到疫苗质量优劣。本研究在去除猪细小病毒种子批中污染的支原体过程中，尝试几种不同方法，试图摸索出有效去除病毒培养物中支原体的方法。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1病毒和细胞

猪细小病毒（PPVHNZK-1第35代）；猪肾传代细胞系（PK15）均由河南农业大学传染病学教研室保存。

1.1.2主要试剂和仪器

TaqTM酶、DL2000DNAmarker等为大连宝生物工程公司产品；DMEM培养液为美国Gibco公司产品；新生牛血清为美国Hyclone公司产品；支原体抑制药物M-plasmocin为Invitrogen公司产品；氯仿为分析纯。

1.2方法

1.2.1猪鼻支原体检测

猪鼻支原体检测参照Kobayashi等[14]建立的PCR方法，正向引物（F）：5′-TATCGCATGATGAGTAATAG-3′；反向引物（R）：5′-GCTGCGTTAGTGAAATTAT-3′，扩增片段理论跨度为676bp，由生工生物（上海）股份有限公司合成，PAGE纯化。DNA模板提取使用酚/氯仿抽提法，PCR扩增体系：10×PCRbuffer（含有Mg2+）2.5μL，dNTPs50μmol/L，上下游引物各20pmol，TaqDNApolymerase2.5U，DNA模板0.1μg，加灭菌双蒸水补至50μL。反应过程：95℃预变性5min；95℃30s，58℃30s，72℃40s，30个循环；最后72℃延伸10min。产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2不同处理方法去除支原体效果比较

分别采用过滤法、反复冻融法、支原体抑制药物处理法和氯仿抽提法处理污染有猪鼻支原体的猪细小病毒培养物，具体操作为：过滤法是使用无菌注射器抽取1mL污染有支原体的猪细小病毒液通过0.10μm滤膜过滤，分别过滤1、2、3次。反复冻融法是将污染有支原体的猪细小病毒液分别反复冻融5、10、15次。支原体抑制药物处理法是在污染有支原体的猪细小病毒液中加入终浓度为25μg/mL的支原体抑制药物M-plasmocin于4℃下作用，设置12、24、36、48、60、72、84、96h8个作用时间。氯仿抽提法是将污染有支原体的猪细小病毒液与等体积氯仿混合，剧烈振荡混匀后在室温静置作用，设5、10、15、20、25、30min6个作用时间，然后1000g离心5min，分别取上清用于接种细胞。将上述方法处理后的病毒液分别接种猪细小病毒敏感的猪肾（PK-15）细胞系，待90%细胞出现病变时收毒，并将收获的病毒连续传代5次，利用PCR方法逐代检测支原体，以评价每种方法去除支原体的效果。

2结果

图1显示，分别将污染有支原体的猪细小病毒液用0.10μm滤膜过滤1、2、3次后接种PK-15细胞，在收获的第5代病毒液中仍能检测到猪鼻支原体。图2显示，分别将污染有支原体的猪细小病毒液冻融5、10、15次后接种PK-15细胞，在收获的第5代病毒液中仍能检测到猪鼻支原体。endprint

使用支原体抑制药物M-plasmocin对猪细小病毒液于37℃水浴中作用不同时间，处理12～72h后接种PK-15细胞，收获第5代病毒液中猪鼻支原体检测为阳性，处理84～96h后接种PK-15细胞，第5代病毒液中支原体检测结果为阴性（图3）。表明该药物对猪鼻支原体有抑制和消灭的作用，在37℃作用84h以上能清除猪细小病毒种子批中污染的猪鼻支原体。

[FK（W13][TPGLF3.tif；S+3mm][FK）]

使用氯仿处理污染有支原体的猪细小病毒液，结果表明，氯仿处理5～30min后接种PK-15细胞，收获的第5代病毒液中猪鼻支原体检测结果均为阴性，作用5min即可有效地清除猪细小病毒种子批中污染的支原体（图4）。

3讨论

猪细小病毒引起种猪的繁殖障碍，给养猪业带来巨大经济损失。目前对该病的防治主要是以灭活疫苗免疫为主，因此制备灭活疫苗的病毒种子批质量直接关乎疫苗成品的质量和安全性，支原体是细胞培养过程中常见的污染物质[15]，并由此污染病毒种子批，由于支原体可引起细胞病变，干扰病毒复制[16]，影响疫苗病毒的产量和质量，并有可能对疫苗的使用带来危险，因此需要一种简单有效且对病毒感染性没有影响的方法来消除支原体[17]。

支原体大小介于细菌和病毒之间，最小为0.2μm，但其具有变形性，使用0.10μm滤膜过滤时，在一定压力下可能改变形态通过滤膜，所以仅通过滤膜过滤不能完全清除支原体。不过可以相对减少支原体的含量，结合其他清除支原体的方法可以更有效地清除支原体的污染。

支原体抑制药物M-plasmocin是Invitrogen公司推出的用于清除细胞中支原体污染的试剂，它作用于支原体的蛋白系统和干扰其DNA复制，该药物在推荐使用浓度对细胞几乎没有毒副作用。本研究在4℃水浴中，支原体抑制药物M-plasmocin与污染有支原体的猪细小病毒液作用，84h能有效清除支原体。但是由于支原体抑制药物M-plasmocin价格昂贵，该方法成本较高。

支原体具有蛋白质和脂质组成的膜样结构，其中胆固醇含量较多，约占36%，对保持其细胞膜的完整性具有一定作用。脂溶剂氯仿能与胆固醇发生作用并破坏支原体膜状结构，杀死支原体，而猪细小病毒不含脂质囊膜，对氯仿不敏感。本研究利用猪细小病毒和支原体对氯仿敏感性不同，尝试用氯仿抽提达到去除猪细小病毒液中污染的支原体。本试验摸索了氯仿与猪细小病毒液的作用时间，表明静置作用5min可有效清除猪细小病毒液中污染的支原体，表明氯仿抽提法对支原体的清除效果很好。由于脂溶剂氯仿对于具有脂质囊膜的病毒具有破坏和灭活作用，故该方法只能用于清除非囊膜病毒中污染的支原体。支原体污染源可能存在于实验室和生产的各个细节（工作环境、培养器皿、培养基）。这就要求生产及检验过程中严格遵循生物制品生产及检验规范，做到对工作环境定期消毒，严格区分人员和物品的流通通道，实验或生产操作前对操作平台和生产设备彻底消毒。由于支原体污染比较隐蔽，一旦病毒种子批被支原体污染，将对生物制品质量造成影响。所以实验和生产过程中杜绝和清除支原体污染是保证病毒种子批纯净和生物制品质量的基础。

本研究用支原体抑制药物处理和氯仿抽提2种方法成功地清除了猪细小病毒种子批中污染的支原体，而且这2种方法均不影响病毒的感染性，为疫苗等生物制品的质量和安全提供了保障。

参考文献：[HT8.SS][HJ1.75mm]

[1]VolokhovDV，GrahamLJ，BrorsonKA，etal.Mycoplasmatestingofcellsubstratesandbiologics：Reviewofalternativenon-microbiologicaltechniques[J].MolecularandCellularProbes，2011，25（2/3）：69-77.

[2]TimenetskyJ，SantosLM，BuzinhaniM，etal.DetectionofmultiplemycoplasmainfectionincellculturesbyPCR[J].BrazilianJournalofMedicalandBiologicalResearch，2006，39（7）：907-914.

[3]Dusanic[DD（-1*2][HT7]'[DD）]D，BercicRL，CizeljI，etal.Mycoplasmasynoviaeinvadesnon-phagocyticchickencellsinvitro[J].VeterinaryMicrobiology，2009，138（1/2）：114-119.

[4]UenoPM，TimenetskyJ，CentonzeVE，etal.Interactionofmycoplasmagenitaliumwithhostcells：evidencefornuclearlocalization[J].Microbiology，2008，154（Pt10）：3033-3041.

[5]RottemS.Interactionofmycoplasmaswithhostcells[J].PhysiologicalReviews，2003，83（2）：417-432.

[6]KulcsarG，FarsangA，SoosT.TestingforviralcontaminantsofveterinaryvaccinesinHungary[J].Biologicals，2010，38（3）：346-349.

[7]严冬梅，张勇，王东艳，等.浅析支原体污染对非脊髓灰质炎肠道病毒分离率的影响[J].中国计划免疫，2004，10（6）：329-332.

[8]郭伟干，冀锡林.支原体污染与病毒增殖、疫苗免疫效力的关系[J].中国畜禽传染病，1990，54（5）：63-65.

[9]中国生物制品标准化委员会.中国生物制品规程[M].北京：化学工业出版社，2000：31-331.

[10]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：化学工业出版社，2005：附录ⅫB75-761.

[11]杨吉成，宋礼华，周建华，等.医用细胞工程[M].上海：上海交通大学出版社，2003.

[12]UphoffCC，DrexlerHG.Comparativeantibioticeradicationofmycoplasmainfectionsfromcontinuouscelllines[J].InVitroCellular&DevelopmentalBiology-Animal，2002，38（2）：86-89.

[13]高林，廖德芳，姚俊，等.用乙基环丙沙星重建受猪鼻支原体污染的BHK-21细胞的研究[J].中国畜牧兽医，2011，38（12）：45-49.

[14]KobayashiH，MorozumiT，MiyamotoC，etal.Mycoplasmahyorhinisinfectionlevelsinlungsofpigletswithporcinereproductiveandrespiratorysyndrome（PRRS）[J].TheJournalofVeterinaryMedicalScience，1996，58（2）：109-113.

[15]吴尚辉，彭聪，顾焕华，等.体外细胞培养支原体的检测与清除[J].中国现代医学杂志，2004，14（12）：111-113.

[16]周佽想，郭萌，李稻，等.支原体污染对重组逆转录病毒的产生和感染靶细胞的影响[J].上海交通大学学报：医学版，2008，28（12）：1527-1530.

[17]徐程林，陈波，陈秀珍，等.疫苗毒种支原体检测中去除本病毒干扰方法的探索[J].中国生物制品学杂志，2009，22（11）：1141-1144.endprint

使用支原体抑制药物M-plasmocin对猪细小病毒液于37℃水浴中作用不同时间，处理12～72h后接种PK-15细胞，收获第5代病毒液中猪鼻支原体检测为阳性，处理84～96h后接种PK-15细胞，第5代病毒液中支原体检测结果为阴性（图3）。表明该药物对猪鼻支原体有抑制和消灭的作用，在37℃作用84h以上能清除猪细小病毒种子批中污染的猪鼻支原体。

[FK（W13][TPGLF3.tif；S+3mm][FK）]

使用氯仿处理污染有支原体的猪细小病毒液，结果表明，氯仿处理5～30min后接种PK-15细胞，收获的第5代病毒液中猪鼻支原体检测结果均为阴性，作用5min即可有效地清除猪细小病毒种子批中污染的支原体（图4）。

3讨论

猪细小病毒引起种猪的繁殖障碍，给养猪业带来巨大经济损失。目前对该病的防治主要是以灭活疫苗免疫为主，因此制备灭活疫苗的病毒种子批质量直接关乎疫苗成品的质量和安全性，支原体是细胞培养过程中常见的污染物质[15]，并由此污染病毒种子批，由于支原体可引起细胞病变，干扰病毒复制[16]，影响疫苗病毒的产量和质量，并有可能对疫苗的使用带来危险，因此需要一种简单有效且对病毒感染性没有影响的方法来消除支原体[17]。

支原体大小介于细菌和病毒之间，最小为0.2μm，但其具有变形性，使用0.10μm滤膜过滤时，在一定压力下可能改变形态通过滤膜，所以仅通过滤膜过滤不能完全清除支原体。不过可以相对减少支原体的含量，结合其他清除支原体的方法可以更有效地清除支原体的污染。

支原体抑制药物M-plasmocin是Invitrogen公司推出的用于清除细胞中支原体污染的试剂，它作用于支原体的蛋白系统和干扰其DNA复制，该药物在推荐使用浓度对细胞几乎没有毒副作用。本研究在4℃水浴中，支原体抑制药物M-plasmocin与污染有支原体的猪细小病毒液作用，84h能有效清除支原体。但是由于支原体抑制药物M-plasmocin价格昂贵，该方法成本较高。

支原体具有蛋白质和脂质组成的膜样结构，其中胆固醇含量较多，约占36%，对保持其细胞膜的完整性具有一定作用。脂溶剂氯仿能与胆固醇发生作用并破坏支原体膜状结构，杀死支原体，而猪细小病毒不含脂质囊膜，对氯仿不敏感。本研究利用猪细小病毒和支原体对氯仿敏感性不同，尝试用氯仿抽提达到去除猪细小病毒液中污染的支原体。本试验摸索了氯仿与猪细小病毒液的作用时间，表明静置作用5min可有效清除猪细小病毒液中污染的支原体，表明氯仿抽提法对支原体的清除效果很好。由于脂溶剂氯仿对于具有脂质囊膜的病毒具有破坏和灭活作用，故该方法只能用于清除非囊膜病毒中污染的支原体。支原体污染源可能存在于实验室和生产的各个细节（工作环境、培养器皿、培养基）。这就要求生产及检验过程中严格遵循生物制品生产及检验规范，做到对工作环境定期消毒，严格区分人员和物品的流通通道，实验或生产操作前对操作平台和生产设备彻底消毒。由于支原体污染比较隐蔽，一旦病毒种子批被支原体污染，将对生物制品质量造成影响。所以实验和生产过程中杜绝和清除支原体污染是保证病毒种子批纯净和生物制品质量的基础。

本研究用支原体抑制药物处理和氯仿抽提2种方法成功地清除了猪细小病毒种子批中污染的支原体，而且这2种方法均不影响病毒的感染性，为疫苗等生物制品的质量和安全提供了保障。

参考文献：[HT8.SS][HJ1.75mm]

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[4]UenoPM，TimenetskyJ，CentonzeVE，etal.Interactionofmycoplasmagenitaliumwithhostcells：evidencefornuclearlocalization[J].Microbiology，2008，154（Pt10）：3033-3041.

[5]RottemS.Interactionofmycoplasmaswithhostcells[J].PhysiologicalReviews，2003，83（2）：417-432.

[6]KulcsarG，FarsangA，SoosT.TestingforviralcontaminantsofveterinaryvaccinesinHungary[J].Biologicals，2010，38（3）：346-349.

[7]严冬梅，张勇，王东艳，等.浅析支原体污染对非脊髓灰质炎肠道病毒分离率的影响[J].中国计划免疫，2004，10（6）：329-332.

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[13]高林，廖德芳，姚俊，等.用乙基环丙沙星重建受猪鼻支原体污染的BHK-21细胞的研究[J].中国畜牧兽医，2011，38（12）：45-49.

[14]KobayashiH，MorozumiT，MiyamotoC，etal.Mycoplasmahyorhinisinfectionlevelsinlungsofpigletswithporcinereproductiveandrespiratorysyndrome（PRRS）[J].TheJournalofVeterinaryMedicalScience，1996，58（2）：109-113.

[15]吴尚辉，彭聪，顾焕华，等.体外细胞培养支原体的检测与清除[J].中国现代医学杂志，2004，14（12）：111-113.

[16]周佽想，郭萌，李稻，等.支原体污染对重组逆转录病毒的产生和感染靶细胞的影响[J].上海交通大学学报：医学版，2008，28（12）：1527-1530.

[17]徐程林，陈波，陈秀珍，等.疫苗毒种支原体检测中去除本病毒干扰方法的探索[J].中国生物制品学杂志，2009，22（11）：1141-1144.endprint

使用支原体抑制药物M-plasmocin对猪细小病毒液于37℃水浴中作用不同时间，处理12～72h后接种PK-15细胞，收获第5代病毒液中猪鼻支原体检测为阳性，处理84～96h后接种PK-15细胞，第5代病毒液中支原体检测结果为阴性（图3）。表明该药物对猪鼻支原体有抑制和消灭的作用，在37℃作用84h以上能清除猪细小病毒种子批中污染的猪鼻支原体。

[FK（W13][TPGLF3.tif；S+3mm][FK）]

使用氯仿处理污染有支原体的猪细小病毒液，结果表明，氯仿处理5～30min后接种PK-15细胞，收获的第5代病毒液中猪鼻支原体检测结果均为阴性，作用5min即可有效地清除猪细小病毒种子批中污染的支原体（图4）。

3讨论

猪细小病毒引起种猪的繁殖障碍，给养猪业带来巨大经济损失。目前对该病的防治主要是以灭活疫苗免疫为主，因此制备灭活疫苗的病毒种子批质量直接关乎疫苗成品的质量和安全性，支原体是细胞培养过程中常见的污染物质[15]，并由此污染病毒种子批，由于支原体可引起细胞病变，干扰病毒复制[16]，影响疫苗病毒的产量和质量，并有可能对疫苗的使用带来危险，因此需要一种简单有效且对病毒感染性没有影响的方法来消除支原体[17]。

支原体大小介于细菌和病毒之间，最小为0.2μm，但其具有变形性，使用0.10μm滤膜过滤时，在一定压力下可能改变形态通过滤膜，所以仅通过滤膜过滤不能完全清除支原体。不过可以相对减少支原体的含量，结合其他清除支原体的方法可以更有效地清除支原体的污染。

支原体抑制药物M-plasmocin是Invitrogen公司推出的用于清除细胞中支原体污染的试剂，它作用于支原体的蛋白系统和干扰其DNA复制，该药物在推荐使用浓度对细胞几乎没有毒副作用。本研究在4℃水浴中，支原体抑制药物M-plasmocin与污染有支原体的猪细小病毒液作用，84h能有效清除支原体。但是由于支原体抑制药物M-plasmocin价格昂贵，该方法成本较高。

支原体具有蛋白质和脂质组成的膜样结构，其中胆固醇含量较多，约占36%，对保持其细胞膜的完整性具有一定作用。脂溶剂氯仿能与胆固醇发生作用并破坏支原体膜状结构，杀死支原体，而猪细小病毒不含脂质囊膜，对氯仿不敏感。本研究利用猪细小病毒和支原体对氯仿敏感性不同，尝试用氯仿抽提达到去除猪细小病毒液中污染的支原体。本试验摸索了氯仿与猪细小病毒液的作用时间，表明静置作用5min可有效清除猪细小病毒液中污染的支原体，表明氯仿抽提法对支原体的清除效果很好。由于脂溶剂氯仿对于具有脂质囊膜的病毒具有破坏和灭活作用，故该方法只能用于清除非囊膜病毒中污染的支原体。支原体污染源可能存在于实验室和生产的各个细节（工作环境、培养器皿、培养基）。这就要求生产及检验过程中严格遵循生物制品生产及检验规范，做到对工作环境定期消毒，严格区分人员和物品的流通通道，实验或生产操作前对操作平台和生产设备彻底消毒。由于支原体污染比较隐蔽，一旦病毒种子批被支原体污染，将对生物制品质量造成影响。所以实验和生产过程中杜绝和清除支原体污染是保证病毒种子批纯净和生物制品质量的基础。

本研究用支原体抑制药物处理和氯仿抽提2种方法成功地清除了猪细小病毒种子批中污染的支原体，而且这2种方法均不影响病毒的感染性，为疫苗等生物制品的质量和安全提供了保障。

参考文献：[HT8.SS][HJ1.75mm]

[1]VolokhovDV，GrahamLJ，BrorsonKA，etal.Mycoplasmatestingofcellsubstratesandbiologics：Reviewofalternativenon-microbiologicaltechniques[J].MolecularandCellularProbes，2011，25（2/3）：69-77.

[2]TimenetskyJ，SantosLM，BuzinhaniM，etal.DetectionofmultiplemycoplasmainfectionincellculturesbyPCR[J].BrazilianJournalofMedicalandBiologicalResearch，2006，39（7）：907-914.

[3]Dusanic[DD（-1*2][HT7]'[DD）]D，BercicRL，CizeljI，etal.Mycoplasmasynoviaeinvadesnon-phagocyticchickencellsinvitro[J].VeterinaryMicrobiology，2009，138（1/2）：114-119.

[4]UenoPM，TimenetskyJ，CentonzeVE，etal.Interactionofmycoplasmagenitaliumwithhostcells：evidencefornuclearlocalization[J].Microbiology，2008，154（Pt10）：3033-3041.

[5]RottemS.Interactionofmycoplasmaswithhostcells[J].PhysiologicalReviews，2003，83（2）：417-432.

[6]KulcsarG，FarsangA，SoosT.TestingforviralcontaminantsofveterinaryvaccinesinHungary[J].Biologicals，2010，38（3）：346-349.

[7]严冬梅，张勇，王东艳，等.浅析支原体污染对非脊髓灰质炎肠道病毒分离率的影响[J].中国计划免疫，2004，10（6）：329-332.

[8]郭伟干，冀锡林.支原体污染与病毒增殖、疫苗免疫效力的关系[J].中国畜禽传染病，1990，54（5）：63-65.

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[10]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：化学工业出版社，2005：附录ⅫB75-761.

[11]杨吉成，宋礼华，周建华，等.医用细胞工程[M].上海：上海交通大学出版社，2003.

[12]UphoffCC，DrexlerHG.Comparativeantibioticeradicationofmycoplasmainfectionsfromcontinuouscelllines[J].InVitroCellular&DevelopmentalBiology-Animal，2002，38（2）：86-89.

[13]高林，廖德芳，姚俊，等.用乙基环丙沙星重建受猪鼻支原体污染的BHK-21细胞的研究[J].中国畜牧兽医，2011，38（12）：45-49.

[14]KobayashiH，MorozumiT，MiyamotoC，etal.Mycoplasmahyorhinisinfectionlevelsinlungsofpigletswithporcinereproductiveandrespiratorysyndrome（PRRS）[J].TheJournalofVeterinaryMedicalScience，1996，58（2）：109-113.

[15]吴尚辉，彭聪，顾焕华，等.体外细胞培养支原体的检测与清除[J].中国现代医学杂志，2004，14（12）：111-113.

[16]周佽想，郭萌，李稻，等.支原体污染对重组逆转录病毒的产生和感染靶细胞的影响[J].上海交通大学学报：医学版，2008，28（12）：1527-1530.

[17]徐程林，陈波，陈秀珍，等.疫苗毒种支原体检测中去除本病毒干扰方法的探索[J].中国生物制品学杂志，2009，22（11）：1141-1144.endprint