岩黄连的高频再生体系建立与优化

韦范+李翠+韦坤华+王晓峰+郭晓云+李林轩

摘要：以岩黄连（CorydalissaxicolaBunting）茎尖为外植体，以MS、1/2MS为基本培养基，采用正交试验探讨植物生长调节剂多因素组合（6-BA、NAA、IAA、IBA、AC）对岩黄连初代诱导、不定芽分化、诱导生根的影响。结果表明，岩黄连不定芽最佳诱导培养基为：MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/LIAA。6-BA浓度过低会导致植物丛生芽较少、繁殖速度减缓，6-BA浓度过高又会导致丛生芽出现玻璃化、变形。在MS+0.6mg/L6-BA+0.2mg/LIBA+0.2mg/LIAA培养基中，岩黄连不定芽能够进行高效繁殖，不但增殖倍数非常高，而且芽苗质量非常好。

关键词：岩黄连；组织培养；不定芽；基质

中图分类号：R284；S567.23+9.043文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0068-03

岩黄连（CorydalissaxicolaBunting）别称石生黄堇，为紫堇科紫堇属多年生草本植物，全草含脱氢卡维丁（岩黄连碱）等活性成分，具有显著的抗菌、消炎、镇痛、安定作用，并有抑制肿瘤细胞作用，主治疮疖肿毒、肝炎、肝硬化、肝癌等症，多见于桂西北山区[1-3]。岩黄连总生物碱注射剂、片剂等中药制剂及产品已被研制出来，并已批量投产[4]。由于人为破坏、生境脆弱等原因，岩黄连野生资源濒临枯竭，难以满足药材市场的需求。本研究利用现代生物技术，建立岩黄连高频再生体系，为岩黄连组织培养规模化生产育苗提供技术支撑，旨在为更好地开发利用岩黄连药用植物资源提供依据。

1材料与方法

1.1材料

岩黄连采自广西药用植物园科研基地，采用其茎尖作为材料展开诱导。将岩黄连茎尖洗净，用75%乙醇灭菌30s，再用无菌水涮洗1遍，将洗干净的茎尖置于0.1%HgCl2溶液（加1～2点表面活性物质吐温）中浸泡消毒5～10min，用无菌水浸洗2次，每次浸洗5min，用无菌纸将材料表层水分吸干，然后置于MS培养基上进行培养，平均光照度为2000lx，光照时间12h/d，温度（25±3）℃。

1.2不定芽诱导

在MS培育基上以NAA（0.1、0.2、0.4mg/L）、IAA（0.1、0.2、0.4mg/L）、6-BA（0、0.5、1.0mg/L）3种不同类型激素的3个水平进行正交试验，对岩黄连不定芽诱导进行改进与优化，每处理10瓶，每瓶4个外植体，30d后记录外植体的诱导情况，比较不同组合诱导不定芽能力的差异。

1.3丛生芽繁殖

在MS培育基上以6-BA（0.3、0.6、1.0mg/L）、IAA（0.1、0.2、0.4mg/L）、IBA（0.1、0.2、0.4mg/L）3种激素的3个水平进行正交试验，对岩黄连的繁殖培养基进行优化，每处理10瓶，每瓶4个单芽，30d后测试管苗生长情况、芽增殖倍数。

1.4生根培养

为了选择最理想的生根培育基，在1/2MS培育基上以IBA（0.2、0.5、1.0mg/L）、NAA（0.1、0.3、0.5mg/L）、AC（0、0.3、0.5g/L）3种激素的3个水平进行正交试验，对岩黄连的生根培养基进行优化，每处理10瓶，每瓶10个单芽，30d之后记录生根率与生根数。

1.5炼苗及移栽

挑选生长旺盛、根系发达的试管苗移入常温室内，在盖上盖子的状态下松开盖子，2d后掀开盖子，让岩黄连幼苗与空气完全接触，其间向瓶内洒水保持瓶内水分充足。3d后取出幼苗，洗净根部的培养基，移入装有事先消毒好的黄沙、蛭石、泥炭、泥炭+蛭石（1∶1）、泥炭+黄沙（1∶1）5种不同基质上，适度遮阴，并保持一定的湿度，30d后统计不同基质中组培苗的成活率。

2结果与分析

2.1消毒时间筛选

消毒时间分别设5、6、7、8、9、10min6个梯度，接种后15d统计岩黄连的污染率与成活率。由表1可知，持续消毒灭菌8min，消毒灭菌效果最佳，成功率高达85%。消毒8min，污染率较高，灭菌时间超过8min，污染率有所下降，但是死亡率明显上升，消毒10min的外植体死亡率达60%。

2.2不定芽的诱导

用茎尖作为外植体接入初代诱导培养基，7d左右切口处开始增大疏松，颜色逐渐变乳黄色，15d左右培养基上长出翠绿色的不定芽，20d时不定芽成簇生长，呈翠绿色。从表2可以看出，0.5mg/L6-BA+0.2mg/LIAA+0.2mg/LNAA条件下，不定芽个数最多。各激素对不定芽的诱导影响由大到小依次为：6-BA>IAA>NAA。当6-BA浓度保持在0～0.5mg/L之间时，不定芽数量与浓度成正比；当6-BA浓度高于0.5mg/L时，二者成反比关系，并且不定芽变为黄绿色，说明6-BA浓度过高会对不定芽诱导起到抑制影响。低浓度生长素有利于不定芽诱导及生长。当IAA浓度在0.1～0.2mg/L范围时，不定芽数量与浓度成正比，当其浓度高于0.2mg/L，就会起到相反的效果。NAA对不定芽的诱导影响不显著，可以不考虑（表3）。所以，选取MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/LIAA培养基诱导岩黄连不定芽（图1）。

2.3丛生芽继代

将长0.5～1.0cm的不定芽切下接种到繁殖培养基上。由表4、表5可见，6-BA对岩黄连不定芽增殖倍数影响极显著。不定芽增殖倍数的范围为3.4～7.3。当6-BA浓度为1.0mg/L时，岩黄连生长现象异常，如有轻微玻璃化；当6-BA浓度为0.6mg/L时，岩黄连植株健壮、展叶良好。IBA浓度对岩黄连增殖倍数影响不显著，但对苗质量有影响，当IBA浓度为0.2mg/L时，芽苗翠绿色，长势快，质量好，有利于后期诱导生根。因此，在MS+0.6mg/L6-BA+0.2mg/L

IBA+0.2mg/LIAA培养基中，岩黄连不定芽能够进行高效繁殖。重复试验发现，在此培养基上不但增殖倍数非常高，而且芽苗质量也非常好（图2）。

2.4丛生芽诱导生根试验

将生长健壮的芽苗单切接入岩黄连生根培养基中，30d后统计生根率及平均生根数（表6）。IBA浓度对试管苗生根率影响极显著，NAA对试管苗生根率影响显著，AC对岩黄连试管苗生根率影响不大（表7、表8）。生根率、平均生根数都主要受IBA浓度的影响，当IBA浓度为0.2～0.5mg/L，随着IBA浓度升高，岩黄连试管苗生根率、平均生根数增加；当IBA浓度大于0.5mg/L，生根率、平均生根数均降低。当NAA浓度在0.1～0.3mg/L范围内时，岩黄连试管苗平均生根数、生根率均与浓度呈正比，但是如果NAA浓度超出0.3mg/L，则两者均降低，NAA浓度过高会影响丛生芽的进一步生根。1/2MS+0.5mg/LIBA+0.3mg/LNAA+0.5g/LAC生根培养基中，岩黄连试管苗生根率达100%，平均生根数达26.7条（图3）。

2.5再生苗的移栽

由表9可知，不同基质成活率由高到低依次为泥炭+蛭石（1∶1）>泥炭+黄沙（1∶1）>蛭石>黄沙>泥炭。因此，试管苗移栽最适宜基质为泥炭+蛭石（1∶1），移栽30d成活率为84%。

3结论与讨论

理生化过程受基因的控制。促进植物发育物质的浓度与分类、外植物体的属性、不同植物激素的比例成分都会对不定芽的生成产生至关重要的影响。本研究表明，没有细胞分裂素（6-BA）的对照组不定芽诱导率较低，说明岩黄连茎尖不定芽诱导中，细胞分裂素是必需的。低浓度的IAA有助于不定芽的形成。本研究表明，岩黄连不定芽最佳诱导培养基为MS+6-BA0.5mg/L+IAA0.2mg/L。本试验中，6-BA浓度过低会导致植物丛生芽较少、繁殖速度减缓，6-BA浓度过高又会导致丛生芽玻璃化、变形。IBA属于植物内源生长素，植物无需借助其他外力就能够自动生成，具有促进细胞分裂、发育等功能。在组织培养过程中，内源激素形成速度较慢，无法满足植物生长的需求，需要从培养基中吸收。不同种类的生产调节素多管齐下，效果要比只使用1种激素好很多[5-8]。本研究表明，在MS+0.6mg/L6-BA+0.2mg/LIBA+0.2mg/LIAA培养基中，岩黄连不定芽能够进行高效繁殖，不但增殖倍数非常高，而且芽苗质量非常好。生根的关键因素是选苗，主要是依据苗的健壮程度进行，虽然苗高也可作为1项参考指标，但并不是主要因素。生根时应选择健壮度与高度都达到要求的组培苗进行生根培养。岩黄连移栽试验出现萎蔫现象主要是由于岩黄连移栽之后，根部与土壤基质还没有相互适应，但是根系及叶片的呼吸作用没有停止，产

生大量水分，叶片利用二氧化碳、阳光进行光合作用，消耗营养，导致叶片在消耗水分、养分，但是根部又供应不上。岩黄连所生之处主要集中在山岩边缘等危险、阴凉区域。因此在栽培中要保持一定的湿度及温度，每天给叶片喷洒少量水，移栽5d后可在水中加入少量液体生根培养基促进根的生长。

参考文献：

[1]文和群，许兆然，Villa-LobosJ，等.中国南部石灰岩稀有濒危植物名录[J].广西植物，1993，13（2）：110-127.

[2]广西壮族自治区卫生厅.广西中药材标准[M].南宁：广西科学技术出版社，1992.

[3]毛宇昂，梁永红.岩黄连的研究综述[J].时珍国医国药，2006，17（4）：630-631.

[4]蒋水元，胡兴华，赵瑞峰.岩黄连引种栽培研究[J].广西植物，2002，22（5）：469-473.

[5]姜灵敏，徐有明，张冬梅，等.红刺玫愈伤组织诱导再生体系的建立[J].江苏农业学报，2012，28（4）：914-916.

[6]苏钛，黄宁珍，付传明.匙羹藤组织培养条件优化研究[J].广西植物，2009，29（1）：87-91.

[7]陈豫，胡伟，何磊.不同浓度激素对胡萝卜愈伤组织诱导的影响[J].江苏农业科学，2013，41（2）：54-56.

[8]王菲彬，王斐，管玲玲，等，植物激素对东方百合试管苗鳞片分化不定芽的影响[J].江苏农业科学，2013，41（6）：53-55.

IBA+0.2mg/LIAA培养基中，岩黄连不定芽能够进行高效繁殖。重复试验发现，在此培养基上不但增殖倍数非常高，而且芽苗质量也非常好（图2）。

2.4丛生芽诱导生根试验

将生长健壮的芽苗单切接入岩黄连生根培养基中，30d后统计生根率及平均生根数（表6）。IBA浓度对试管苗生根率影响极显著，NAA对试管苗生根率影响显著，AC对岩黄连试管苗生根率影响不大（表7、表8）。生根率、平均生根数都主要受IBA浓度的影响，当IBA浓度为0.2～0.5mg/L，随着IBA浓度升高，岩黄连试管苗生根率、平均生根数增加；当IBA浓度大于0.5mg/L，生根率、平均生根数均降低。当NAA浓度在0.1～0.3mg/L范围内时，岩黄连试管苗平均生根数、生根率均与浓度呈正比，但是如果NAA浓度超出0.3mg/L，则两者均降低，NAA浓度过高会影响丛生芽的进一步生根。1/2MS+0.5mg/LIBA+0.3mg/LNAA+0.5g/LAC生根培养基中，岩黄连试管苗生根率达100%，平均生根数达26.7条（图3）。

2.5再生苗的移栽

由表9可知，不同基质成活率由高到低依次为泥炭+蛭石（1∶1）>泥炭+黄沙（1∶1）>蛭石>黄沙>泥炭。因此，试管苗移栽最适宜基质为泥炭+蛭石（1∶1），移栽30d成活率为84%。

3结论与讨论

理生化过程受基因的控制。促进植物发育物质的浓度与分类、外植物体的属性、不同植物激素的比例成分都会对不定芽的生成产生至关重要的影响。本研究表明，没有细胞分裂素（6-BA）的对照组不定芽诱导率较低，说明岩黄连茎尖不定芽诱导中，细胞分裂素是必需的。低浓度的IAA有助于不定芽的形成。本研究表明，岩黄连不定芽最佳诱导培养基为MS+6-BA0.5mg/L+IAA0.2mg/L。本试验中，6-BA浓度过低会导致植物丛生芽较少、繁殖速度减缓，6-BA浓度过高又会导致丛生芽玻璃化、变形。IBA属于植物内源生长素，植物无需借助其他外力就能够自动生成，具有促进细胞分裂、发育等功能。在组织培养过程中，内源激素形成速度较慢，无法满足植物生长的需求，需要从培养基中吸收。不同种类的生产调节素多管齐下，效果要比只使用1种激素好很多[5-8]。本研究表明，在MS+0.6mg/L6-BA+0.2mg/LIBA+0.2mg/LIAA培养基中，岩黄连不定芽能够进行高效繁殖，不但增殖倍数非常高，而且芽苗质量非常好。生根的关键因素是选苗，主要是依据苗的健壮程度进行，虽然苗高也可作为1项参考指标，但并不是主要因素。生根时应选择健壮度与高度都达到要求的组培苗进行生根培养。岩黄连移栽试验出现萎蔫现象主要是由于岩黄连移栽之后，根部与土壤基质还没有相互适应，但是根系及叶片的呼吸作用没有停止，产

生大量水分，叶片利用二氧化碳、阳光进行光合作用，消耗营养，导致叶片在消耗水分、养分，但是根部又供应不上。岩黄连所生之处主要集中在山岩边缘等危险、阴凉区域。因此在栽培中要保持一定的湿度及温度，每天给叶片喷洒少量水，移栽5d后可在水中加入少量液体生根培养基促进根的生长。

参考文献：

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[8]王菲彬，王斐，管玲玲，等，植物激素对东方百合试管苗鳞片分化不定芽的影响[J].江苏农业科学，2013，41（6）：53-55.

IBA+0.2mg/LIAA培养基中，岩黄连不定芽能够进行高效繁殖。重复试验发现，在此培养基上不但增殖倍数非常高，而且芽苗质量也非常好（图2）。

2.4丛生芽诱导生根试验

将生长健壮的芽苗单切接入岩黄连生根培养基中，30d后统计生根率及平均生根数（表6）。IBA浓度对试管苗生根率影响极显著，NAA对试管苗生根率影响显著，AC对岩黄连试管苗生根率影响不大（表7、表8）。生根率、平均生根数都主要受IBA浓度的影响，当IBA浓度为0.2～0.5mg/L，随着IBA浓度升高，岩黄连试管苗生根率、平均生根数增加；当IBA浓度大于0.5mg/L，生根率、平均生根数均降低。当NAA浓度在0.1～0.3mg/L范围内时，岩黄连试管苗平均生根数、生根率均与浓度呈正比，但是如果NAA浓度超出0.3mg/L，则两者均降低，NAA浓度过高会影响丛生芽的进一步生根。1/2MS+0.5mg/LIBA+0.3mg/LNAA+0.5g/LAC生根培养基中，岩黄连试管苗生根率达100%，平均生根数达26.7条（图3）。

2.5再生苗的移栽

由表9可知，不同基质成活率由高到低依次为泥炭+蛭石（1∶1）>泥炭+黄沙（1∶1）>蛭石>黄沙>泥炭。因此，试管苗移栽最适宜基质为泥炭+蛭石（1∶1），移栽30d成活率为84%。

3结论与讨论

理生化过程受基因的控制。促进植物发育物质的浓度与分类、外植物体的属性、不同植物激素的比例成分都会对不定芽的生成产生至关重要的影响。本研究表明，没有细胞分裂素（6-BA）的对照组不定芽诱导率较低，说明岩黄连茎尖不定芽诱导中，细胞分裂素是必需的。低浓度的IAA有助于不定芽的形成。本研究表明，岩黄连不定芽最佳诱导培养基为MS+6-BA0.5mg/L+IAA0.2mg/L。本试验中，6-BA浓度过低会导致植物丛生芽较少、繁殖速度减缓，6-BA浓度过高又会导致丛生芽玻璃化、变形。IBA属于植物内源生长素，植物无需借助其他外力就能够自动生成，具有促进细胞分裂、发育等功能。在组织培养过程中，内源激素形成速度较慢，无法满足植物生长的需求，需要从培养基中吸收。不同种类的生产调节素多管齐下，效果要比只使用1种激素好很多[5-8]。本研究表明，在MS+0.6mg/L6-BA+0.2mg/LIBA+0.2mg/LIAA培养基中，岩黄连不定芽能够进行高效繁殖，不但增殖倍数非常高，而且芽苗质量非常好。生根的关键因素是选苗，主要是依据苗的健壮程度进行，虽然苗高也可作为1项参考指标，但并不是主要因素。生根时应选择健壮度与高度都达到要求的组培苗进行生根培养。岩黄连移栽试验出现萎蔫现象主要是由于岩黄连移栽之后，根部与土壤基质还没有相互适应，但是根系及叶片的呼吸作用没有停止，产

生大量水分，叶片利用二氧化碳、阳光进行光合作用，消耗营养，导致叶片在消耗水分、养分，但是根部又供应不上。岩黄连所生之处主要集中在山岩边缘等危险、阴凉区域。因此在栽培中要保持一定的湿度及温度，每天给叶片喷洒少量水，移栽5d后可在水中加入少量液体生根培养基促进根的生长。

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[8]王菲彬，王斐，管玲玲，等，植物激素对东方百合试管苗鳞片分化不定芽的影响[J].江苏农业科学，2013，41（6）：53-55.