小鼠原钙黏蛋白的多样性分析及其亚型的克隆与表达

2015-01-15王武明索伦周雨潇鲁琳吴强

江苏农业科学 2014年11期

王武明+索伦+周雨潇+鲁琳+吴强

摘要：原钙黏蛋白（protocadherin）是广泛分布于中枢神经系统的一类跨膜蛋白，是钙黏蛋白家族中最大的亚族。成簇Pcdh基因包含3个串联的基因簇——Pcdhα、β、γ，其中Pcdhα和γ分别由14个和22个可变区及各自共同的恒定区组成。这种特殊蛋白结构决定了原钙黏蛋白各亚型在功能上既相似又不完全相同，为了系统研究原钙黏蛋白各个亚型的功能，本研究对原钙黏蛋白家族氨基酸序列保守性进行了系统性分析，并据此设计特异性的引物来完成原钙黏蛋白各个亚型的克隆；并以原钙黏蛋白α1基因为例，通过PCR方法成功将其从小鼠大脑中克隆并构建到带有Myc标签的真核表达载体pcDNA3.1上；利用脂质体转染方法将该基因成功表达于293T细胞。本研究结果将为后续其他亚型的克隆建立技术平台。

关键词：原钙黏蛋白；基因；克隆；小鼠；亚型；氨基酸序列

中图分类号：Q785文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2014）11-0034-03

根据原钙黏蛋白在基因组上的排布可以分为非成簇原钙黏蛋白和成簇原钙黏蛋白，成簇原钙黏蛋白在神经系统中大量表达，是钙黏蛋白超家族中最大的一个亚家族[1]。成簇原钙黏蛋白包含3个串联基因簇——α、β、γ[2]。其中原钙黏蛋白α和γ分别由14个和22个可变区及各自共同的恒定区组成，并通过基因的可变剪接编码成36种原钙黏蛋白分子，而原钙黏蛋白β的22个成员仅分别由1个外显子编码而成[2]。研究表明，原钙黏蛋白在神经突触发育过程中起直接作用，作为黏附分子加强神经突触的连接，在突触特异性形成过程中也发挥重要作用[3]。原钙黏蛋白根据其胞内段的差异可以分为A类型和B类型，A类型在调节学习记忆和海马5-羟色胺总量上起重要的作用[4]，原钙黏蛋白α和γ负调控PYK2活性，依赖胞内区与PYK2结合[5]，并通过PYK2-RhoGTPase通路调节细胞骨架从而影响神经元树突发育[6]，结果表明，原钙黏蛋白经由调节细胞黏附来建立神经元连接。迄今为止，已经发现大约60多种原钙黏蛋白在中枢神经系统中表达[7]。原钙黏蛋白与典型的钙黏蛋白一样，由6个胞外EC结构域、跨膜区和胞内区3部分组成，各亚型在结构上高度相似，在氨基酸序列上却不完全相同[2，8]。众多研究结果表明，原钙黏蛋白各个亚型在神经元发育过程中分别发挥着独特的作用。为了系统探索各个亚型的作用，本研究通过软件分析原钙黏蛋白α家族氨基酸序列保守性，以原钙黏蛋白α1基因为例将其构建到pcDNA3.1载体并顺利表达，结果将为原钙黏蛋白其他亚型克隆及其后续功能研究建立技术平台。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞和表达载体真核表达载体pcDNA3.1（—）mycHisA购自Invitrogen；293T细胞系由上海交通大学肿瘤所实验室赠送。

1.1.2试剂和酶类Tris碱、甘氨酸、过硫酸铵和十二烷基磺酸钠购自Sigma-Aldrich公司。无水乙醇、甲醇、氯化钠、乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸钠等试剂购自国药集团化学试剂有限公司；TRIzolReagent购自Gibco（lifetechnologies）公司；胰化蛋白胨与酵母提取物购自Oxoid公司；RT-PCR试剂盒、电泳级琼脂糖和核糖核酸酶购自Promega公司；质粒小抽和胶回收试剂盒购自Axygen公司；质粒中抽试剂盒购自Qiagen公司。30%Acr/Bis储备胶溶液和封闭用脱脂奶粉，购自Bio-Rad公司；胰蛋白酶和胎牛血清购自Gibco公司；100bpDNALaddermarker、1kbDNALaddermarker购自宝生物工程（大连）有限公司；Opti-MEMI液体培养基、Lipofectamine2000、蛋白markerSeebluePlus2PrestainedStandard购自Invitrogen公司；T4连接酶、限制性内切酶购自NewEnglandBiolabs公司；RIPA细胞裂解液购自碧云天公司。

1.1.3引物本试验所用引物由上海生工生物工程技术公司合成上游引物PF：5′-AGCTCGAGCTCGATACGGAAAGTGCAGTAC-3′包含1个XhoⅠ酶切位点。

下游引物PR：5′-AGCAAGCTTACACTGGTCACTGTTGTCCGT-3′包含1个HindⅢ酶切位点。

1.1.4抗体mouseanti-Myc（Millipore），mouseanti-β-actin（Abcam），mouseanti-protocadherinα由艾比玛特公司定制生产。

1.2方法

1.2.1总RNA的提取

取小鼠大脑组织50～100mg，加1mLTRIzol试剂，在冰上将组织捣碎，12000r/min，4℃离心10min，将上清液转移至另外无核酸酶的离心管里，室温孵育5min，然后加0.2mL氯仿，急剧摇晃15s，室温孵育3min，12000r/min，4℃离心15min，转移分界面上层无色液体到另外离心管中，加0.5mL异丙醇沉淀RNA，室温放置10min，12000r/min，4℃离心10min，去除上清液，加1mL75%乙醇洗RNA沉淀，然后7500r/min，4℃离心5min，去除上清，加无核酸酶的水溶解RNA沉淀。

1.2.2RT-PCR

运用2步法，第1步首先合成cDNA：取1μg总RNA，70℃，10min，简单离心后放置在冰上。准备20μL反应体系，包括4μL25mmol/LMgCl2，逆转录10×缓冲液2μL，10mmol/LdNTP混合液2μL，重组RNasin核糖核酸酶抑制剂0.5μL，AMV逆转录酶15U，Oligo（dT）15引物或随机引物0.5μg，总RNA1μg，加无核酸酶的水到20μL体积。如果用Oligo（dT）15引物扩增，将反应体系放于42℃，15min；如果用随机引物扩增，将反应体系室温放置10min，然后放置在42℃，15min。最后95℃热激样品5min，放于0～5℃，5min。

第2步PCR：以反转录得到的cDNA为模板，以PF、PR为引物进行PCR扩增。PCR反应参数：94℃预变性2min；94℃变性15s，57℃退火30s，68℃延伸3min，30个循环；最后68℃7min。PCR产物用0.8%的琼脂糖凝胶电泳分离，用胶回收试剂盒回收纯化。

1.2.3重组质粒pcDNA3.1-Myc-Pcdhα1的构建

PCR扩增原钙黏蛋白α1经电泳、胶回收纯化后用限制性内切酶XhoⅠ和HindⅢ消化，连接到用同样酶切割了多克隆位点的pcDNA3.1载体上。

1.2.4JM109感受态进行转化，用氨苄抗性平板筛选克隆。

1.2.5菌落PCR鉴定、酶切鉴定和测序

菌落PCR挑取单克隆菌落，稀释于10L灭菌水中，以1L菌液为模板，配成10L反应体系。PCR反应参数：94℃预变性2min；94℃变性20s，57℃退火30s，68℃延伸3min，26个循环；最后68℃7min。菌落PCR鉴定正确后，将剩余的9L菌液小摇扩繁，第2天小抽提取质粒。

酶切鉴定测定小抽质粒浓度，酶切体系：质粒200ng，10×BSA0.5μL，10×酶切缓冲液0.5μL，限制性内切酶XhoⅠ0.3μL，HindⅢ0.3μL，加无菌水至5μL，放于37℃，1h。琼脂糖凝胶电泳检测片段大小。酶切鉴定正确后测序。

1.2.6重组质粒在真核细胞中表达

将鉴定正确的重组菌用含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基进行扩大培养。14～16h后，收获菌液，中抽质粒。用6孔板培养293T细胞，待细胞长至80%～90%时，用Lipofectamine2000转染细胞，48h后收获细胞。用RIPA裂解液裂解细胞，蛋白悬浮液4℃，12000r/min离心20min。取上清加2×Loadingbuffer99℃煮5min，用于蛋白质免疫印迹试验。

2结果与分析

2.1原钙黏蛋白α家族多样性分析

利用DNAMAN软件分析原钙黏蛋白α家族氨基酸序列保守性发现，由可变外显子编码的氨基酸序列保守性较差，尤其在接近跨膜区的一段胞内域，有一段特异性很强的序列，但胞内段C端有一段较长的氨基酸序列（150个氨基酸）完全一样，这种特殊的蛋白结构决定了原钙黏蛋白各亚型之间在功能上既有其相似性又不完全相同（图1）。

2.2原钙黏蛋白α1基因的克隆和表达载体构建

2.2.1RT-PCR扩增原钙黏蛋白α1基因以反转录的cDNA第1条链为模板，以PF、PR为引物PCR，用0.8%的琼脂糖进行电泳，在2800bp左右获得与目的片段大小相同的扩增条带，结果如图2所示。

2.2.2菌落PCR鉴定以单克隆菌落为模板，以PF、PR为引物PCR，扩增得到2874bp的目的条带，结果如图3所示。

2.2.3重组质粒在293T细胞中的表达

重组质粒转染到293T细胞中，过表达原钙黏蛋白α1基因，通过Westernblot方法，分别用mouseanti-Myc和mouseanti-protocadherinα抗体检测，结果如图4、图5所示，在110ku处有1条明显的蛋白条带，对照没有条带，而β-actin的表达量几乎一致，说明α1基因成功表达。

3结论与讨论

原钙黏蛋白在脊椎动物中广泛存在[9]，在神经系统中广泛表达[7]，而且包含数十种亚型[2]，各亚型在神经元特异性识别中分别起重要作用[10-11]。相关文献报道，原钙黏蛋白α和γ家族基因可以调节神经元发育和突触形成[6，12]，这对解释某些重大神经疾病有重要的启示作用。本研究利用DNAMAN软件分析了原钙黏蛋白α家族氨基酸序列保守性，对其蛋白质多样性进行分析，发现整个家族各亚型在胞内区有一段氨基酸序列完全一样，但胞外区和小部分胞内区保守性较差，这决定了各亚型在功能上既有相似性又不完全相同。本研究成功克隆原钙黏蛋白α1基因并构建到pcDNA3.1载体上。克隆原钙黏蛋白α1基因全长，为后期系统研究原钙黏蛋白各个亚型的作用打下了基础，是进一步深入研究原钙黏蛋白家族基因的有力工具。

参考文献：[HJ1.7mm]

[1]SanoK，TaniharaH，HeimarkRL，etal.Protocadherins：alargefamilyofcadherin-relatedmoleculesincentralnervoussystem[J].EMBOJournal，1993，12（6）：2249-2256.

[2]WuQ，ManiatisT.Astrikingorganizationofalargefamilyofhumanneuralcadherin-likecelladhesiongenes[J].Cell，1999，97（6）：779-790.

[3]WeinerJA，WangXZ，TapiaJC，etal.Gammaprotocadherinsarerequiredforsynapticdevelopmentinthespinalcord[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，2005，102（1）：8-14.

[4]FukudaE，HamadaS，HasegawaS，etal.Down-regulationofprotocadherin-alphaAisoformsinmicechangescontextualfearconditioningandspatialworkingmemory[J].EuropeanJournalofNeuroscience，2008，28（7）：1362-1376.

[5]ChenJ，LuYY，MengSX，etal.Alpha-andgamma-protocadherinsnegativelyregulatePYK2[J].JournalofBiologicalChemistry，2009，284（5）：2880-2890.

[6]SuoL，LuHN，YingGX，etal.ProtocadherinclustersandcelladhesionkinaseregulatedendritecomplexitythroughRhoGTPase[J].JournalofMolecularCellBiology，2012，4（6）：362-376.

[7]ZouC，HuangW，YingG，etal.Sequenceanalysisandexpressionmappingoftheratclusteredprotocadheringenerepertoires[J].Neuroscience，2007，144（2）：579-603.

[8]WuQ，ZhangT，ChengJF，etal.ComparativeDNAsequenceanalysisofmouseandhumanprotocadheringeneclusters[J].GenomeResearch，2001，11（3）：389-404.

[9]WuQ.Comparativegenomicsanddiversifyingselectionoftheclusteredvertebrateprotocadheringenes[J].Genetics，2005，169（4）：2179-2188.

[10]LefebvreJL，KostadinovD，ChenWV，etal.Protocadherinsmediatedendriticself-avoidanceinthemammaliannervoussystem[J].Nature，2012，488（7412）：517-521.

[11]ChenWV，AlvarezFJ，LefebvreJL，etal.Functionalsignificanceofisoformdiversificationintheprotocadheringammagenecluster[J].Neuron，2012，75（3）：402-409.

[12]GarrettAM，SchreinerD，LobasMA，etal.gamma-ProtocadherinscontrolcorticaldendritearborizationbyregulatingtheactivityofaFAK/PKC/MARCKSsignalingpathway[J].Neuron，2012，74（2）：269-276.