丹参作用于水通道蛋白AQP4 的活性成分虚拟筛选

陈少军 ， 任纪龙

(1. 浙江医药高等专科学校中药系，浙江宁波315000;2. 浙江大学基础医学院生理系神经生理教研室，浙江杭州310000)

丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bunge 的干燥根及根茎，具有活血调经、祛瘀止疼、凉血消痈、除烦安神的功效。现代药理研究表明，丹参具有保护血管内皮细胞、抗动脉粥样硬化、改善微循环、保护心肌、抑制和解除血小板聚集、抑制胶原纤维的产生和促进纤维蛋白的降解、抗脂质过氧化和清除自由基等作用［1］。临床上丹参主要用于治疗心脑血管疾病，是目前活血化瘀药中使用最广泛的一味中药。

中医认为，气血津液生理上同源互化，相互制约，病理上相互为害，一损俱损。丹参同样也会对水液具有一定的调节作用。水通道蛋白(aquaporin，AQPs)是一类特异性跨膜转运水的蛋白，它的正常表达可能是运化水湿、津液输布的分子生物学基础［2］。

因此，作为活血化瘀代表性药物，丹参有可能作用于AQPs 蛋白，如采用传统药理学方法费事费力。本实验利用计算机手段探讨丹参作用于AQP4 的活性成分虚拟筛选，并对其靶标相互作用进行模拟研究。

1 方法与材料

1.1 人工文本数据挖掘 采用人工文本挖掘方式，以丹参、水通道作为检索词，在中国期刊网检索出与之相关的所有文献(检索范围为2013 年5 月16 日前)，剔除不含信息的文献，从中提取丹参作用于水通道的文献信息。

采用人工文本挖掘方式，以Salvia miltiorrhiza、aquaporin 作为检索词，从PubMed 中检索出与之相关的文献(检索范围为2013 年5 月24 日前)，剔除不相关的文献，从中提取相关文献信息。

1.2 虚拟筛选与分子对接 台湾中医药资料库(Traditional Chinese Medicine Dadabase@ Taiwan)是目前全世界最大中医药小分子数据库，里面包含来源于453 种不同中药超过20 000 多种的化学成分。该数据库还提供中药小分子活性成分虚拟筛选、分子对接和分子动力学模拟［3］，被誉为是弥补中药与西药分歧的桥梁［4］。

台湾中医药资料库逐渐得到推广和应用，目前文献报道从数据库中38877 个中药化学分子筛选出sodium (+)-isolaricireinol-2 alpha-sulfate、sodium 3，4-dihydroxy-5-methoxybenzoic acid methy ester-4-sulfate 作为H1 药物作用的靶分子［5］。并 筛 选 出2-O-caffeoyl tartaric acid，Emitine，Rosmaricine 和2-O-feruloyl tartaric acid 可能是潜在的EGFR 抑制剂［6］。

丹参作用于AQP4 活性成分虚拟筛选和分子对接工具采用台湾中医药资料库提供Iscreen 在线服务器［7］。

丹参活性成分由台湾中医药资料库提供，包括有脂溶性成分如丹参新酮、二氢丹参酮Ⅰ、二氢异丹参酮Ⅰ、去氢丹参新酮，水溶性成分丹参素、丹参酸B 等。数据库中丹参一共收集了150 个化学成分可用于下一步活性筛选。该数据库的化合物均通过Lipinski’s 类药五原则，化合物3D 结构均采用NM2 力场优化［7］。

蛋白质结构准备是虚拟筛选和分子对接的重要一步。蛋白质数据库PDB (http://www. rcsb. org/pdb/home/home.do)下载AQP4 晶体结构，相对应的PDB 文件是3GD8。采用分子模拟图形界面软件Discovery Studio Visualizer 3.5 删除溶剂分子、去除自带配体，加氢及修正不完整残基等处理，并分析活性区域和核心氨基酸。处理好的蛋白用于下一步虚拟筛选与对接。Arg216 决定了AQP4 的通透性［8］，Arg216，Asp69 同时是与抑制剂arylsulfonamides 计算机对接中结合的核心氨基酸［9］。虚拟筛选与对接中，AQP4 蛋白活性结合区域范围以Arg216，Asp69 核心氨基酸作为参照，其他参数采用默认值。实验结果按照对接打分排序。

1.3 分子模拟图像处理 丹参与活性成分分子对接采用分子图形开源软件pymol 分析处理作图。

2 实验结果

2.1 人工文本检索结果 查询中国期刊网和Pubmed 数据库，文献证实丹参注射液、水煎液或含丹参的复方中药可对多种AQPs 蛋白有作用，作用组织部位和相应文献报道数目详见表1。现有文献报道丹参作用于AQP4 有8 篇，其中作用于脑组织的AQP4 文献为6 篇、1 篇作用于心肌细胞、1 篇作用于胃肠道AQP4。药物包括有丹参川芎嗪注射液、丹红注射液、含丹参的化湿液、脑脉泰胶囊等。

表1 丹参作用于AQPs 的文献信息

但文献报道多集中于提取物或复方上，对于作用于AQPs 的活性成分和分子机制阐述存在一定的困难。如采用传统的方法，费事费力，因此，计算机辅助虚拟筛选提供了一个非常好的方法技术。

2.2 丹参作用于AQP4 虚拟筛选结果 虚拟筛选结果显示，丹参150 个小分子中，与AQP4 对接打分较好分别是:3-(3，4-dihydroxyphenyl)lactamide 打分结果为-64.517 5，原儿茶酸protocatechuic acid 打分结果为-64.450 8，丹参素danshensu 的打分结果为-63.674 1。同时从表中可发现，前5 位小分子化合物打分结果接近，但与第6 位后小分子打分就有明显的差别。详细可见表2。这些化合物可作为AQPs 抑制剂的先导化合物做进一步研究。

2.3 对接结果 为了进一步验证筛选出的丹参小分支，并探讨与AQP4 的结合模式，我们考察了它们的相互作用。

3-(3，4-dihydroxyphenyl)lactamide 与AQP4 蛋 白 中Gly146、Asn206、Gly209、Arg216 形成氢键连接(图1A)。原儿茶酸protocatechuic acid 与AQP4 蛋白的 Gly146、Gly209、Arg216 形成氢键连接，同时还与两个水分子形成氢键连接(图1B)。丹参素danshensu 与AQP4 蛋白Thr56、Gly146、Val147、Gly209、Arg216 形成氢键连接，同时还与一个水分子形成氢键连接(图1C)。

氢键连接在图2 中得到更清楚的展示。3-(3，4-dihydroxyphenyl)lactamide 与AQP4 的Arg216 形成两个N…OH 氢键，与Asn206 形成1 个N…O-H 氢键，键长分别是2.88、2.81、2.72 Å (图2a)。原儿茶酸protocatechuic acid与AQP4 蛋白Arg 形成两个N…O-H 氢键，键长分别为2.91、2.81 Å，与Val147 形成O…O-H 氢键，键长为3.09 Å (图2b)。丹参素danshensu 与AQP4 蛋白Arg216 形成两个N…O-H 氢键，与Gly146 形成一个N…O-H 氢键，与Thr56 形成两个O…O-H 氢键(图2c)。

同时还从图2 中观察到疏水作用，红色睫毛状为残基的疏水作用示意。从图2 中可发现3-(3，4-dihydroxyphenyl)lactamide 与较多的氨基酸发生了疏水作用，而原儿茶酸protocatechuic acid 和丹参素danshensu 的疏水作用相对较少。

3 讨论

中医认为，血与津液同属于液态物质，津血同源、津血转换，都有滋润和濡养作用，生理上可相互转换和相互补充，病理上相互影响。丹参作为活血化瘀传统中药，对津液水液同样具有很强的作用。AQPs 与人体泌尿、消化、呼吸及中枢神经系统的功能密切相关，它的正常表达可能是运化水湿、津液输布的分子生物学基础［2］。通过人工文献检索，我们可发现丹参水煎液、丹参注射液或含丹参的复方可对亚型AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、AQP5、都有作用(表1)。

表2 Iscreen 虚拟筛选出的高匹配打分的丹参活性成分

图1 丹参成分与AQP4 分子对接模式图

图2 丹参活性成分与AQP4 相互作用力示意图

AQP4 是脑组织分布最广泛的蛋白，分布于内皮细胞和胶质细胞中，参与细胞内外水调节、细胞运动和神经递质释放，在脑组织水平衡中起重要作用［18-19］。在许多心脑血管疾病中，丹参通过调节AQP4 蛋白发挥重要作用。大鼠手术脑缺血再灌注致使脑组织含水量增多、损伤加重，而预先给予丹参川芎嗪可以改善大鼠神经损伤、减轻脑水肿、降低AQP4 表达水平［20］。脑脉泰胶囊由红参、三七、当归、丹参、银杏叶、山楂等组成，在大鼠大脑中动脉线栓法导致的局灶性脑缺血再灌注模型中，脉泰胶囊具有保护和减轻脑水肿的作用，可能与其抑制神经细胞凋亡，降低AQP4 表达，减少线粒体和血脑屏障的损伤有关［21］。腹腔注射丹红注射液可降低大鼠急性脑损伤后脑水肿、AQP4 的表达及神经元的凋亡，对脑损伤有明显的治疗作用［15］。在心肌缺血再灌注大鼠模型中，复方丹参滴丸或健心平律丸能减轻心肌缺血水肿损伤及增强心肌细胞AQP4 表达［16］。

Iscreen 是基于台湾中医药资料库的、以高精度PLANTS 和LEA3D 软件包作核心的云端中草药虚拟筛选与分子对接的在线服务器［7］。通过Iscreen 虚拟筛选和分子对接，发现150 个丹参小分子中3-(3，4-dihydroxyphenyl)lactamide、Protocatechuic acid、Danshensu 与AQP4 蛋白结合较好(见表2)。

丹参小分子与AQP4 配体-受体结合图具体可见图1。丹参小分子3-(3，4-dihydroxyphenyl)lactamide、protocatechuic acid、danshensu 均与Arg216 有氢键作用(见图1)。AQPs 水通透效率与通道区域氨基酸所带正电荷密切相关，Arg216 决定了AQP4 的通透性［8］。Protocatechuic acid、danshensu 也都与AQP4 蛋白在Gly209 位也形成了氢键作用(图1B，图1C)。AQP4 蛋白Phe77、Ile81、Val85、Leu170、Ile174、Val197 组成了疏水部分，Gly209、Ala210、Ser211、Met212 则组成了亲水部分，这样可以保证水在水通道中的双向性［8］。这说明了Protocatechuic acid、danshensu 可能也参与水通透的双向性调节。Danshensu 与AQP4 蛋白Thr56形成了氢键(图1C)。根皮素Phloretin 与AQP4 蛋白Thr56，Ile73，Ile205 形成疏水作用［9］。这些都说明了这3 种丹参小分子与AQP4 核心氨基酸存在着相互作用力。

AQP4 蛋白Arg216，His201 直接位于通道中间，将通道直径缩至1.5 埃［8］，这一部位是抑制剂arylsulfonamides，sumatriptan 发挥作用的关键部位［9，22］。丹参小分子3-(3，4-dihydroxyphenyl)lactamide、protocatechuic acid、danshensu与AQP4 蛋白Arg216 残基发生结合后，推测其也起到了通道阻塞从而影响胞内外水的进出，发挥门控作用。因此，可推测这3 个小分子可发挥AQP4 通道抑制剂的功能。

综上所述，丹参与AQP4 关键氨基酸存在相互作用，并可能起到水通道抑制作用，对生理病理条件下AQP4 蛋白功能的发挥可能具有一定的调节作用。

4 结束语

本研究采用TCM Database@Taiwan 和Iscreen 在线虚拟筛选和分子对接方法，从丹参中筛选出3-(3，4-dihydroxyphenyl)lactamide、protocatechuic acid、danshensu 与AQP4结合较好，并分析了配体-受体的活性位点的结合模式。这有利于进一步了解丹参活血化瘀机制，对其在心脑血管疾病中发挥作用具有理论支持作用。

致谢:感谢创腾公司免费提供分子模拟图形界面软件Discovery Studio Visualizer 3.5 (Accelrys 公司出品)。

［1］ 丰成相. 丹参的化学成分及药理作用概况［J］. 中国民族民间医药，2012，21(2):25-26.

［2］ 李姿慧，王 键，蔡荣林. 湿病与水通道蛋白的相关性研究进展［J］. 中西医结合学报，2011，9(1):5-10.

［3］ Chen C Y. TCM Database@ Taiwan:the world＇s largest traditional Chinese medicine database for drug screening in silico［J］. PLoS One，2011，6(1):e15939.

［4］ Sanderson K. Databases aim to bridge the East-West divide of drug discovery［J］. Nat Med，2011，17(12):1531.

［5］ Chang S S，Huang H J，Chen C Y. High performance screening，structural and molecular dynamics analysis to identify H1 inhibitors from TCM Database @ Taiwan［J］. Mol Biosyst，2011，7(12):3366-3374.

［6］ Yang S C，Chang S S，Chen H Y，et al. Identification of potent EGFR inhibitors from TCM Database@ Taiwan［J］. PLoS Comput Biol，2011，7(10):e1002189.

［7］ Tsai T Y，Chang K W，Chen C Y. iScreen:world＇s first cloud-computing web server for virtual screening and de novo drug design based on TCM database@ Taiwan［J］. J Comput Aided Mol Des，2011，25(6):525-531.

［8］ Ho J D，Yeh R，Sandstrom A，et al. Crystal structure of human aquaporin 4 at 1.8 A and its mechanism of conductance［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2009，106(18):7437-7442.

［9］ Huber V J，Tsujita M，Yamazaki M，et al. Identification of arylsulfonamides as Aquaporin 4 inhibitors［J］. Bioorg Med Chem Lett，2007，17(5):1270-1273.

［10］ 李 敏，杨明会，刘 毅. 丹参及其复方对大鼠肺损伤肺AQP1 的调节作用［J］. 中国中医急症，2009，18(1):90-92.

［11］ 董晓静，杨 勇，任秦有，等. 以丹参调节AQP1 的特征表达验证“活血利水”法部分本质［J］. 中国中医急症，2013，22(5):732-735.

［12］ 王建华，郭永泽，张晓岚. 水通道蛋白2 在胆总管结扎大鼠肝硬化肾组织中的表达及丹参注射液对其表达的影响［J］. 世界华人消化杂志，2012，20(25):2393-2396.

［13］ Zhang Y W，Ma X Y，Ding S D，et al. Effects of compound salvia miltiorrhiza injection on aquaporin 3 expression in human amniotic epithelial cells［J］. Chin J Integr Trodit Chin West Med，2013，33(1):51-55.

［14］ Ma X Y，Shen Q，Hua Y，et al. The role of MAPK signal pathway in the regulation of AQP3 expression induced by compound danshen injection in human amniotic epithelial cells［J］.Chin J Integr Trodit Chin West Med，2013，33(6):778-782.

［15］ 王从政，蔡淑芳. 丹红注射液对大鼠脑外伤后AQP4 表达及神经元凋亡的影响［J］. 中西医结合心脑血管病杂志，2012，10(10):1229-1231.

［16］ 何绪屏，陈东风，郑建宏，等. 健心平律丸对大鼠心肌缺血再灌注心律失常和水通道蛋白4 的影响［J］. 中国中西医结合杂志，2004，24(9):823-826.

［17］ 林 青，张前德. 黄芪丹参对干燥综合征模型大鼠颌下腺组织的水通道蛋白-5 表达的影响［J］. 口腔医学，2010，30(8):473-476.

［18］ Papadopoulos M C，Verkman A S. Aquaporin water channels in the nervous system［J］. Nat Rev Neurosci，2013，14(4):265-277.

［19］ Verkman A S，Binder D K，Bloch O，et al. Three distinct roles of aquaporin-4 in brain function revealed by knockout mice［J］. Biochim Biophys Acta，2006，1758(8):1085-1093.

［20］ 刘凤琴. 大鼠脑缺血再灌注后脑组织水通道蛋白4 的表达及丹参川芎嗪干预作用的研究［D］. 山西医科大学，2010.

［21］ 王 征，吴建华，方云祥，等. 脑脉泰胶囊对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤血脑屏障和脑水肿的影响［J］. 中国药学杂志，2009，44(19):1483-1487.

［22］ Huber V J，Tsujita M，Nakada T. Identification of aquaporin 4 inhibitors using in vitro and in silico methods［J］. Bioorg Med Chem，2009，17(1):411-417.