HPLC法测定妇科湿热清颗粒中连翘苷的含量

2015-01-12赵文艳朱法根

中国中医药现代远程教育 2015年20期

赵文艳朱法根李超

赵文艳朱法根李超

（济川药业集团有限公司，泰兴2254 41）

目的建立H PLC法测定妇科湿热清颗粒中连翘苷含量的方法。方法以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为乙腈-水（22∶78），流速1.0 m L/m in，检测波长为277 nm，柱温30℃。结果连翘苷在16.2μg/m l～162μg/m l浓度范围内呈良好的线性关系，r=0.9999，加样回收率为97.45%，R SD为1.36%。结论该方法操作简便、灵敏、可靠，可用于妇科湿热清颗粒的质量控制。

连翘苷；妇科湿热清颗粒；高效液相色谱法

妇科湿热清颗粒是由金银花、连翘、薏苡仁等12味药材制成的中药复方制剂，具有清热利湿之功能。用于湿热蕴结型盆腔炎性疾病后遗症（慢性盆腔痛）。方中连翘为君药，具有清热解毒、消肿散结、疏散风热之功效[1]。连翘有广谱的抗菌作用，且有抗病毒、解热抗炎和抗肝损伤多种药理作用[2-3]；其所含的主要有效成分为连翘苷具有较强的抑菌作用[4]，并能抑制CAFP、磷酸二酯酶的活性[5]。为了提高质量标准，突出对君药连翘的控制，本实验建立连翘苷作为妇科湿热清颗粒定量指标的含测方法，以便更好的控制其制剂质量。

1 仪器与试药

Shimadzu 20A高效液相谱仪（LC-20AT泵，SPD-20A紫外-可见检测器、CTO-10ASVP柱温箱、SIL-20A自动进样器）；Fettler XS205型电子分析天平。连翘苷（批号：110821-200711，供含量测定用，含量以98.9%计，中国药品生物制品检定所）；妇科湿热清颗粒（批号：140715，济川药业集团有限公司）；乙腈、甲醇均为色谱纯（国药集团化学试剂有限公司）；水为重蒸馏水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水（22∶78）为流动相；检测波长为277 nm；流速：1.0 ml/min；理论板数按连翘苷峰计算应不低于3000。

2.2 对照品制备方法取连翘苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含80μg的溶液，即得。

2.3 供试品制备方法取装量差异项下的本品，研细，取约3.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇30 ml，超声处理（功率200 W，频率58 KHz）30分钟，放冷，滤过，滤液置水浴浓缩约2 mL，加在中性氧化铝柱（100～200目，2 g，内径为1 cm）上，用70%乙醇100 mL分数次洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用50%甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 专属性实验原处方去除连翘药材，按制剂工艺制备得连翘的阴性制剂。按照供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液，测定。

比较对照品溶液、阴性样品溶液和供试品溶液的色谱图（见图1、2、3），结果显示，阴性样品溶液在连翘苷相应的保留时间处无吸收峰，表明阴性样品无干扰，该方法具有专属性。

图1 连翘苷对照品溶液H PLC色谱图

图2 阴性样品溶液H P LC色谱图

图3 供试品溶液H P LC色谱图

2.5 检测灵敏度将对照品溶液逐级稀释，以信噪比约为10∶1，确定其定量限；以信噪比约为3∶1，确定其检测限。当信噪比为10∶1时，连翘苷的进样量为10.52 ng；当信噪比约为3∶1时，连翘苷的进样量为3.16 ng。

2.6 线性关系考察精密称取连翘苷16.38 mg置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液一；精密量取对照品溶液一15 mL、10 mL、5 mL、2 mL，分别置20 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为对照品溶液二、三、四、五。分别精密吸取对照品溶液一、二、三、四、五各10μL，注入液相色谱仪，测定。以浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y=6805.5X+ 2420.5，r=0.9999，结果表明连翘苷在16.2μg/mL～162 μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。

2.7 对照品精密度实验精密吸取同一连翘苷对照品溶液10μL，连续进样6次，测定，试验结果对照品日内精密度RSD为0.20%，日间精密度RSD为0.40%，表明该方法进样精密度较好。

2.8 中间精密度试验同一批样品（批号140715），不同操作人员、不同时间、不同仪器设备，依法进行测定，试验结果RSD为1.5%，表明中间精密度良好。

2.9 样品稳定性试验精密吸取同一样品（批号140715）供试液10ul，分别于0、2、4、6、8、12、17小时进样，测定，试验结果样品稳定性RSD为1.45%，表明供试品溶液中连翘苷在17 h内稳定。

2.10 重复性试验取同一样品（批号140715）6份，精密称定，按供试品溶液制备方法处理，依法测定，试验结果6份样品测定结果RSD为0.88%，表明该方法重复性较好。

2.11 加样回收率试验取含量已知样品（批号140715），进行加样回收率试验。取6份，每份约1.5 g，精密称定，分别精密加入一定量的连翘苷对照品溶液（0.034 mg/mL），按2.3项下方法制备供试品溶液，测定（见表1）。

表1 加样回收率试验测定结果

试验结果显示，连翘苷平均加样回收率为97.45%，RSD为1.36%，表明该方法准确度良好。

2.12 样品含量测定取3批样品（150101、150102、150103）依法检测，分别为0.98、0.96、0.99（mg/袋）。

3 讨论

3.1 色谱条件的选择根据连翘苷对照品溶液在200～400 nm范围内扫描结果，连翘苷在277 nm有最大吸收，确定其检测波长为277 nm。通过流动相乙腈：水不同比例25∶75[6]、22∶78、19∶81[7]比较，其中22∶78分离度相对较好，故选择流动相比例为乙腈-水（22∶78）。试验中考察了不同色谱柱（Phenomenex Gemini 5μ C18 110A 250×4.6mm柱（1）、Phenomenex Gemini 5μ C18 110A 250×4.6mm柱（2）及Phenomenex Luna 5μ C18（2）100A 250×4.6mm柱）、不同仪器（Shimadzu 20A高效液相色谱仪和Agilent 1100高效液相色谱仪）的影响，试验结果连翘苷的分离度及对称性均良好，表明该方法系统耐用性均良好。

3.2 供试品溶液制备方法本制剂供试品处理方法考察了萃取法（氯仿、正丁醇）与上中性氧化铝柱法，结果表明上中性氧化铝柱方法杂质较少且提取含量较高，故选用上中性氧化铝柱。同时考察了不同提取方式（加热回流、超声、冷浸30分钟）、不同提取溶剂（甲醇、50%甲醇）、不同提取时间（15 min、30 min、 45 min）、不同溶剂用量（20 mL、30 mL、40 mL）对妇科湿热清颗粒中连翘苷提取率的影响；结果表明甲醇超声提取连翘苷提取率较高且方法简便可行，提取时间30 min、提取溶剂30 ml可以充分提取连翘苷。此外，还考察了氧化铝用量（1.5 g、2 g、2.5 g）对连翘苷提取率的影响，1.5 g含量较高，但吸附不完全，峰形不好；2.5 g峰形较好，但不能完全洗脱，含量较低；2 g峰形较好，且含量较高；故选择氧化铝用量为2 g。最后选择采用加入30 mL甲醇，超声处理30分钟，放冷，滤过，滤液置水浴浓缩约2 mL，加在中性氧化铝柱（100～200目，2 g，内径为1 cm）上，用70%乙醇100 mL分数次洗脱来制备供试品溶液。以上分析方法验证结果表明，本方法操作简便、灵敏、可靠，适合妇科湿热清颗粒的质量控制。

[1]国家药典委员会．中国药典(一部)[S]．北京:中国医药科技出版社，2010:197．

[2]胡静，马琳，张坚，等．连翘的研究进展[J]．中南药学，2012，10(10):760-764．

[3]李双，王东强，李志军．连翘药理作用小议[J]．西部中医药，2012，25(1):52-54．

[4]姜涛，张立伟．连翘抗菌-谱效关系研究[J]．化学研究与应用，2015，27(3): 256-261．

[5]曾嵘，阎敏，刘建存．H PLC法测定胜红清热片中连翘苷的含量研究[J]．中医药导报，2006，12(8):96-97．

[6]雷建林，李艳桃，聂会生，等．H PLC法测定不同产地连翘药材中连翘苷的量[J]．中华中医药学刊，2012，30(1):202-203．

[7]李艳丽，张虹，陈湘玲．H PLC法测定连菊清热胶囊中连翘苷的含量[J]．山西医科大学学报，2012，10(43):747-749．

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2015年2月10日

ZHAO Wenyan, ZHU Fagen, Li Chao(Jumpcan Pharmaceutical Group Co. , Ltd. , Jiangsu Province, Taixing 225441, China)

ObjectiveTo establish a HPLC method for the determination of phillyrin in Fuke Shireqing granules.MethodsOctadecylsilane chemically bonded silica was used as bulking agent.The mobile phase was consisted of acetonitrile-water（22：78）with the flow rate of 1.0mL/min，and the detection wavelength was 277nm，with the column temperature at 30℃.ResultsPhillyrin showed a good linearity in the concentration range of 16.2μg/ml～162μg/ml，the coefficient was 0.9999，the average recovery was 97.45%，and RSD was 1.36%.ConclusionThe method is simple，sensitive and suitable，and can be used for the quality controlof Fuke Shireqing granules.

Phillyrin；Fuke Shireqing granules；HPLC

1672-2779（2015）-20-0147-03