菱花粉生活力测定方法研究

李双梅+柯卫东+彭静+李峰+钟兰+孙亚林

摘 要：为了探索菱花粉生活力的最佳测定方法，以孝感红菱花粉为试材，利用无机盐培养法、MTT（四甲基噻唑蓝）染色法和TTC（氯化三苯基四氮唑）染色法对花粉生活力进行测定。研究结果表明，培养基中添加低浓度的蔗糖和硼酸对菱花粉的萌发有促进作用，菱花粉萌发的最适培养基为10%蔗糖+0.005%硼酸，萌发率达65.9%；用MTT染色法和TTC染色法测定菱花粉生活力，染色率仅为36.9%和27.1%，效果不理想。

关键词：菱；花粉；生活力；萌发率

中图分类号：S645.4 文献标识码：A 文章编号：1001-3547（2014）18-0045-03

菱（Trapa spp.），别名菱角、龙角、水粟等，为菱科菱属一年生水生草本植物，起源于欧洲和亚洲的温暖地区[1]，中国是菱的原产地之一[2]。菱在中国的分布范围较广，中国长江流域及其以南各省、自治区均有栽培。

研究菱花粉生活力对杂交育种及种质创新有重要意义。目前，国内学者在菱的分类[3]、形态学[4]、细胞学[5]、生理生化[6]、栽培技术[7]等方面做了大量工作，在菱属植物传粉生物学方面也有少量研究[8]，而有关适宜菱花粉生活力测定方法的研究却未见报道。花粉生活力测定的方法很多，主要有显微镜形态观测法、染色法、培养基发芽法等[9]。本文采用无机盐培养法、MTT染色法和TTC染色法对孝感红菱花粉生活力进行测定，以期找到菱花粉生活力测定的最佳方法，为菱的杂交育种及种质创新提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于2012年8月在国家种质武汉水生蔬菜资源圃采集孝感红菱萼片刚开裂的花蕾。剥取花药，放入培养皿中，置于（25±1）℃的电热恒温箱中培养4～5 h，收集花粉备用[10]。

1.2 花粉生活力的测定方法

①无机盐培养法 无机盐基液的配制参照胡适宜[11]的方法。取硼酸（H3BO3）0.1 g、硝酸钙（Ca（NO3）2·4H2O）0.3 g、硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.1 g、硝酸钾（KNO3）0.1 g，配制成100 mL无机盐基液。设5%、10%、15%、20%、25%、30% 6种不同质量分数蔗糖和0、0.005%、0.01%、0.015% 4种不同质量分数硼酸的完全随机试验，共24个处理，A，5%蔗糖；B，5%蔗糖+0.005%硼酸；C，5%蔗糖+0.01%硼酸；D，5%蔗糖+0.015%硼酸；E，10%蔗糖；F，10%蔗糖+0.005%硼酸；G，10%蔗糖+0.01%硼酸；H，10%蔗糖+0.015%硼酸；I，15%蔗糖；J，15%蔗糖+0.005%硼酸；K，15%蔗糖+0.01%硼酸；L，15%蔗糖+0.015%硼酸；M，20%蔗糖；N，20%蔗糖+0.005%硼酸；O，20%蔗糖+0.01%硼酸；P，20%蔗糖+0.015%硼酸；Q，25%蔗糖；R，25%蔗糖+0.005%硼酸；S，25%蔗糖+0.01%硼酸；T，25%蔗糖+0.015%硼酸；U，30%蔗糖；V，30%蔗糖+0.005%硼酸；W，30%蔗糖+0.01%硼酸；X，30%蔗糖+0.015%硼酸。取少量菱花粉于载玻片上，分别加1～2滴上述培养液，将制备好的片子放在垫有二层湿润滤纸的培养皿内，于（25±1）℃条件下培养，3～4 h后观察花粉萌发率。

②MTT染色法 MTT溶液配制参照张研等[12]的方法。称0.5 g MTT于烧杯，溶解于5%蔗糖溶液25 mL中，后装入棕色试剂瓶，置于冰箱中避光保存。取少量菱花粉于载玻片上，加1～2滴配制好的MTT溶液，盖上盖玻片，在室温下放置10 min，然后在Olympus光学显微镜下观察。染成紫色的花粉生活力强，染成淡红色的生活力次之，不能染色的是没有生活力的花粉或不育花粉。

③TTC染色法 取少量菱花粉放到载玻片上，加1～2滴0.5% TTC溶液，搅拌均匀，盖上盖玻片，将其在（35±1）℃电热恒温箱内放置15～20 min。然后在Olympus光学显微镜下观察，被染成红色的花粉生活力强，被染成淡红色的花粉生活力次之，不能染色的花粉为失去生活力的花粉或不育花粉。

以上每种方法观察3个制片，每个制片观察5个视野，分别统计有生活力花粉粒数和无生活力花粉粒数，计算花粉的活力百分率。花粉活力百分率的计算公式为花粉活力百分率（%）=（有活力花粉粒数/总花粉粒数）×100%；花粉萌发率的计算公式为花粉萌发率（%）=（萌发花粉粒数/总花粉粒数）×100%。

2 结果与分析

2.1 不同浓度蔗糖、硼酸对花粉萌发的影响

从表1可看出，在无添加硼酸、5%～30%蔗糖浓度下（处理A、E、I、M、Q、U），花粉萌发率极低，几乎不发芽；在0.015%硼酸、5%～30%蔗糖浓度下（处理D、H、L、P、T、X），花粉萌发率也不高，在 2.0%～32.0%；在5%和30%蔗糖浓度下（处理A、B、C、D和处理U、V、W、X），花粉萌发率也很低，在0～39.4%；以10%蔗糖+0.005%硼酸（处理F）花粉萌发率最高，达65.9%，其次是15%蔗糖+0.005%硼酸（处理J），花粉萌发率达57.9%，再次是10%蔗糖+0.01%硼酸（处理G）和20%蔗糖+0.005%硼酸（处理N），花粉萌发率分别为51.0%和50.5%，表明菱花粉在低浓度蔗糖和低浓度硼酸下萌发率高。综合来看，本试验中以10%蔗糖+0.005%硼酸最适合菱花粉萌发。

2.2 MTT染色法菱花粉生活力的测定结果

通过光学显微镜观察，用MTT染色后，染成紫色和淡红色（有生活力）的花粉占36.9%，不能染色（没有生活力）的花粉占63.1%，测定结果明显偏低于无机盐培养法最佳培养基测定菱花粉的萌发率（65.9%），不能真实反映菱花粉的生活力。因此，MTT染色法不适宜作为菱花粉生活力的测定方法。

2.3 TTC染色法菱花粉生活力的测定结果

通过光学显微镜观察发现，用TTC染色后，染成红色和淡红色（有生活力）的花粉占27.1%，不能染色（没有生活力）的花粉占72.9%，此方法测定的菱花粉生活力更低。因此，TTC染色法也不适宜作为菱花粉生活力的测定方法。

3 结论与讨论

培养基发芽法是花粉生活力应用较广泛的一种方法，测定结果较精确可靠[13]。有研究认为，在培养基中加入适当浓度的蔗糖和硼酸利于花粉萌发。蔗糖不仅为花粉萌发和花粉管生长提供养分，还维持花粉与培养液之间的渗透平衡，防止花粉和花粉管破裂[14]。硼酸能促进糖的吸收和代谢，与糖结合可以提高花粉的萌发率，增加氧气的含量和吸收，参与果胶物质的合成[15]，有利于花粉管的建造[13]。本文分别采用不同浓度的蔗糖和不同浓度的硼酸进行完全随机试验，结果表明，最适宜菱花粉萌发的培养基为10%蔗糖+0.005%硼酸，萌发率达65.9%。

测定花粉生活力的染色方法除MTT染色法和TTC染色法外，还有I2-KI染色法、醋酸洋红染色法和亚甲基蓝染色法等[9]，不同染色法只适合某些植物花粉生活力的测定[9]。本试验中采用MTT法和TTC法测定菱花粉生活力，染色率均较低，不能真实反映菱花粉生活力，2种方法均不宜用于测定菱花粉生活力，同样也证明了以上观点。相比较而言，MTT染色法稍接近无机盐培养法的测定结果，采用不同时期的菱花粉，选用无机盐培养法和MTT染色法进行比较测定，看是否能找到这2种方法在菱花粉生活力测定上的相关性，有待进一步研究。

参考文献

[1] 李曙轩.中国农业百科全书·蔬菜卷[M].北京：中国农业出版社，1990：144-146.

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[7] 宋秀珍，胡家祺，方兆登.关于南湖菱的生物学特性和栽培技术的初步探讨[J].浙江农业科学，1981，（6）：300-304，280.

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[14] 何莉，贾文庆.郁李花粉生活力及贮藏特性的研究[J].天津农业科学，2013，19（5）：5-8.

[15] 崔晓龙，魏蓉城，黄瑞复.苹果花粉生活力的研究[J].云南大学报：自然科学版，1995，17（3）：284-289.

2.3 TTC染色法菱花粉生活力的测定结果

通过光学显微镜观察发现，用TTC染色后，染成红色和淡红色（有生活力）的花粉占27.1%，不能染色（没有生活力）的花粉占72.9%，此方法测定的菱花粉生活力更低。因此，TTC染色法也不适宜作为菱花粉生活力的测定方法。

3 结论与讨论

培养基发芽法是花粉生活力应用较广泛的一种方法，测定结果较精确可靠[13]。有研究认为，在培养基中加入适当浓度的蔗糖和硼酸利于花粉萌发。蔗糖不仅为花粉萌发和花粉管生长提供养分，还维持花粉与培养液之间的渗透平衡，防止花粉和花粉管破裂[14]。硼酸能促进糖的吸收和代谢，与糖结合可以提高花粉的萌发率，增加氧气的含量和吸收，参与果胶物质的合成[15]，有利于花粉管的建造[13]。本文分别采用不同浓度的蔗糖和不同浓度的硼酸进行完全随机试验，结果表明，最适宜菱花粉萌发的培养基为10%蔗糖+0.005%硼酸，萌发率达65.9%。

测定花粉生活力的染色方法除MTT染色法和TTC染色法外，还有I2-KI染色法、醋酸洋红染色法和亚甲基蓝染色法等[9]，不同染色法只适合某些植物花粉生活力的测定[9]。本试验中采用MTT法和TTC法测定菱花粉生活力，染色率均较低，不能真实反映菱花粉生活力，2种方法均不宜用于测定菱花粉生活力，同样也证明了以上观点。相比较而言，MTT染色法稍接近无机盐培养法的测定结果，采用不同时期的菱花粉，选用无机盐培养法和MTT染色法进行比较测定，看是否能找到这2种方法在菱花粉生活力测定上的相关性，有待进一步研究。

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2.3 TTC染色法菱花粉生活力的测定结果

通过光学显微镜观察发现，用TTC染色后，染成红色和淡红色（有生活力）的花粉占27.1%，不能染色（没有生活力）的花粉占72.9%，此方法测定的菱花粉生活力更低。因此，TTC染色法也不适宜作为菱花粉生活力的测定方法。

3 结论与讨论

培养基发芽法是花粉生活力应用较广泛的一种方法，测定结果较精确可靠[13]。有研究认为，在培养基中加入适当浓度的蔗糖和硼酸利于花粉萌发。蔗糖不仅为花粉萌发和花粉管生长提供养分，还维持花粉与培养液之间的渗透平衡，防止花粉和花粉管破裂[14]。硼酸能促进糖的吸收和代谢，与糖结合可以提高花粉的萌发率，增加氧气的含量和吸收，参与果胶物质的合成[15]，有利于花粉管的建造[13]。本文分别采用不同浓度的蔗糖和不同浓度的硼酸进行完全随机试验，结果表明，最适宜菱花粉萌发的培养基为10%蔗糖+0.005%硼酸，萌发率达65.9%。

测定花粉生活力的染色方法除MTT染色法和TTC染色法外，还有I2-KI染色法、醋酸洋红染色法和亚甲基蓝染色法等[9]，不同染色法只适合某些植物花粉生活力的测定[9]。本试验中采用MTT法和TTC法测定菱花粉生活力，染色率均较低，不能真实反映菱花粉生活力，2种方法均不宜用于测定菱花粉生活力，同样也证明了以上观点。相比较而言，MTT染色法稍接近无机盐培养法的测定结果，采用不同时期的菱花粉，选用无机盐培养法和MTT染色法进行比较测定，看是否能找到这2种方法在菱花粉生活力测定上的相关性，有待进一步研究。

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