核桃叶黄酮类化合物的双水相与超声耦合提取

李 羚，李 丽，龚 赛

（保山学院 资源环境学院，云南 保山 678000）

核桃叶黄酮类化合物的双水相与超声耦合提取

李 羚，李 丽，龚 赛

（保山学院 资源环境学院，云南 保山 678000）

将超声波提取技术与丙醇-硫酸铵双水相分离技术进行耦合，从核桃叶中提取黄酮类化合物，提取率为13.9%。与传统的有机溶剂回流提取法（提取率14.2%）相比，该法的提取率略低，但提取过程中体系的温度不会大幅度升高，可有效地保持黄酮的生物活性，而且双水相分离使黄酮的纯度得以提高。

核桃叶；超声波提取；双水相分离；黄酮

有关研究表明，核桃叶含有维生素 B、C、D、E及胡萝卜素、挥发油等多种营养物质和核桃醌、核桃甙、鞣质及黄酮类等生物活性物质［1-2］，具有较高的营养价值和药用价值。而如今，对核桃的利用主要是果实和木材，核桃叶只是被作为肥料或者进行焚烧处理，没有使其价值得到应有的发挥。

超声波提取技术［3］是利用超声的空化作用对原料细胞壁的破坏，有助于有效成分的释放和溶出；同时，超声波使提取液不断震荡，有利于有效成分的扩散；又由于超声波的热效应使水温基本保持在57℃，提取过程的系统温度较低，不会破坏有效成分的生物活性。双水相萃取分离技术［4-7］是被广泛应用于生物提取、天然产物分离等领域的一种新型分离技术。本文将超声波提取技术与双水相萃取分离技术进行耦合，研究核桃叶黄酮的提取分离，以期为开发利用核桃叶资源提供有效途径和理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

核桃叶（10月采自云南省保山市隆阳区），清洗，干燥，用旋风式粉碎磨粉碎；芦丁标准试剂；NaNO2溶液：5%；AlCl3溶液：10%；NaOH溶液：1mol/L；95%乙醇；硫酸铵；正丙醇。

722光栅分光光度计（上海第三分析仪器厂制造）；AS3120超声波清洗仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；2XZ-1型旋片式真空泵（南京真空泵厂）；FS-11旋风式粉碎磨（杭州麦哲仪器有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 丙醇－硫酸铵双水相体系的形成

选择丙醇-硫酸铵双水相作为黄酮的提取分离溶剂。丙醇和水完全互溶，但在丙醇水溶液中加入硫酸铵时，由于硫酸铵的水化作用比丙醇强，丙醇与水的结合力被削弱，当加入的硫酸铵达到一定数量时，丙醇被排斥出盐水相，从而形成双水相。因此，可通过改变硫酸铵的用量、丙醇与水的比例来控制双水相体系的形成。

1.2.2 核桃叶黄酮的提取与分离

按一定的醇-水料液比，在装有1.0 g核桃叶粉末的锥形瓶中加入相应数量的丙醇和水。浸泡核桃叶0.5 h后再加入一定量的硫酸铵，超声波提取一段时间，抽滤，滤液静置分层，取出上层丙醇相，用50%乙醇定容至50 mL即得核桃叶黄酮提取液。

1.2.3 核桃叶黄酮提取率的测定

1.2.3.1 芦丁标准溶液的配制

准确称取充分干燥的芦丁标准试剂0.0572 g，用50%乙醇溶解，然后将其转入100 mL容量瓶中，用50%乙醇定容，配制成质量浓度为0.572mg·mL-1标准溶液。

1.2.3.2 芦丁标准溶液最大吸收波长的测定

准确吸取芦丁标准溶液0.5 mL于25 mL比色管中，用50%乙醇补至12 mL，加入0.7 mL 5%NaNO2摇匀。放置5 min后加入0.7 mL 10%AlCl3，6 min后加入5 mL 1 mol·L-1NaOH，混匀。用50%乙醇稀释至刻度，10 min后测得其最大吸收波长为505 nm，以试剂空白为参比。

1.2.3.3 标准曲线的绘制

分别取上述芦丁标准溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL于6支25 mL容量瓶中，按1.2.3.2 中的步骤加入各种试剂，同时以试剂空白为参比，在505 nm波长处测定吸光度。回归方程：A＝8.9621c+0.0199，R2＝0.9988。

1.2.3.4 核桃叶黄酮提取率的测定

取1.2.2中的核桃叶黄酮提取液0.5 mL于25 mL比色管中，按1.2.3.2中的方法测定吸光度，由回归方程计算核桃叶黄酮提取率。

2 结果与分析

2.1 影响提取率的因素

2.1.1 醇水体积比对黄酮提取率的影响

不同醇水体积比时的黄酮提取率见图1。黄酮提取率先随醇水体积比的增加而增加，在醇水体积比大于0.6后，黄酮提取率变化较小。这是由于醇水体积比较大时，水的相对体积较小，提取液在超声波的作用下不断震荡，使得一些原本应溶于水相的物质反而进入丙醇相，黄酮的提取率因此受到影响。

图1 不同醇水体积比时的黄酮提取率Fig.1 Flavonoids'yield with different alcohol-water ratio

2.1.2 硫酸铵用量对黄酮提取率的影响

不同硫酸铵用量时的黄酮提取率见图2。黄酮提取率先随硫酸铵用量的增加而增加，当硫酸铵用量在0.40～0.50 g·mL-1（水中硫酸铵的质量）时 ，黄酮的提取效果最好；当硫酸铵用量超过0.50 g·mL-1时，黄酮得率则随着硫酸铵用量的增加而减少。由于随着硫酸铵用量的增加，上相丙醇相对浓度增大，对黄酮类化合物的萃取能力增强，黄酮提取率增加。但当硫酸的用量超过其在水中的饱和溶解量后，由于在超声提取过程中固体硫酸铵对黄酮有一定的吸附作用，结果导致黄酮提取率反而减少。

图2 不同硫酸铵用量时的黄酮提取率Fig.2 Flavonoids'yield with different ammonium sulfate concentration

2.1.3 超声时间对黄酮提取率的影响

不同超声时间时的黄酮提取率见图3。黄酮提取率随超声时间的增加先增大，超声时间增至25 min时，黄酮提取率最大，随后逐渐减小。这是由于随着超声时间的增加，丙醇对黄酮的提取更加充分，但时间过长，可能有部分黄酮转化为其它物质，提取率反而降低。

图3 不同超声时间时的黄酮提取率Fig.3 Flavonoids'yield with different ultrasonic time

2.1.4 料液比对黄酮提取率的影响

不同料液比时的黄酮提取率见图4。黄酮提取率随料液比的增加而提高，料液比增至1∶50 g/ mL后黄酮提取率增加缓慢。考虑到节约试剂，并便于后续处理等因素，本文选取1∶40、1∶45、1∶50 g/mL的料液比来优化提取条件。

图4 不同料液比时的黄酮提取率Fig.4 Flavonoids'yield with differentmaterial liquid ratio

2.2 提取条件的优化

根据单因素试验结果，选取优化提取条件的因素水平见表1。

表1 优化提取条件的因素水平Table.1 Optimize the factor levels of extraction condition

根据表1，选用L9（34）正交表进行试验，结果见表2。

表2 L9（34）正交试验结果Table.2 Orthogonal experiment results of L9（34）

从表2极差分析看出，黄酮提取率受4因素影响的大小顺序为：料液比、超声时间、醇水体积比、硫酸铵用量。优化得到的最佳提取条件为A2B2C2D3，即0.6的醇水体积比、0.45 g·mL-1的硫酸铵用量、25 min的超声时间、1∶50的料液比。在此最佳提取条件下重复3次试验，得到黄酮的平均提取率为13.9%，高于正交试验中的最高提取率。

2.3 乙醇水溶液回流提取法的提取率

在乙醇体积分数为60%，料液比1∶30，回流时间2 h的条件下进行提取，核桃叶黄酮提取率为14.2%，稍高于本法的13.9%。

3 结语

该方法能有效地提取核桃叶中的黄酮，虽然提取率略低于传统的有机溶剂回流提取法，但其有两个突出的优点：一是提取过程中体系的温度不会大幅度升高，可有效地保持黄酮的生物活性；二是溶于丙醇相中的黄酮在双水相分离时能与一些水溶性物质进行分离，使黄酮的纯度得以提高。

［1］尉芹，马希汉，韩学文，等.核桃叶抗氧化作用的研究［J］.食品科学，2001，22（7）：81-83.

［2］翟梅枝，韦虹.核桃叶开发利用初探［J］.中国水土保持，1992（8）：40-41.

［3］卢艳花，魏东芝，蒋晓萌.中药有效成分提取分离技术［M］.北京：化学工业出版社，2006：71-72.

［4］Karakatsanis A，Liakopoulou-Kyriakides M.Comparison of PEG/fractionated dextran and PEG/industrial grade dextran aqueous two-phase systems for the enzymic hydrolysis of starch［J］.Journal of Food Engineering，2007，80（4）：1213-1217.

［5］Natália Luiza Penna Dallora，Joo Gabriel Degam Klem et al.Partitioning of model proteins in aqueous twophase systems containing polyethylene glycol and ammonium carbamate［J］.Biochemical Engineering Journal，2007，34（1）：92-97.

［6］高云涛，王伟.金（Ⅲ）在聚乙二醇-硫酸铵双水相体系中的分配行为及萃取机理［J］.应用化学，2002，19（6）：578-581.

［7］Babak Mokhtarani，Ramin Karimzadeh，Mohammad Hassan Amini，et al.Partitioning of Ciprofloxacin in aqueous two-phase system of poly（ethylene glycol）and sodium sulphate［J］.J Biochem Eng.，2008，38 （2）241-247.

Extraction of Flavonoids by Ultrasonic Wave and Aqueous Two-phase System Technology from Walnut Leaves

LI Ling，LI Li，GONG Sai
（Department of Resource and Environment，Bao Shan College，Bao Shan 678000，China）

Flavonoids are extracted from walnut leaves by coupling the ultrasonic extraction technology with propyl alcohol-ammonium sulphate aqueous two-phase extraction technology and the extraction yield can be reached to 13.9%.Compared with conventional organic solvent reflux extraction（extraction yield of 14.2%），this yield is a slightly lower，however by this method，in the extraction process the system temperature dose not rise significantly，and the biological activity of flavonoids could be maintained effectively，meanwhile the aqueous two-phase could improve the purity of flavonoids.

walnut leaves；ultrasonic extraction；aqueous two-phase system；flavonoids

TQ35

A

1004-275X（2015）04-0019-03

12.3969/j.issn.1004-275X.2015.04.006

收稿：2015-05-06

保山学院科研教研基金重点项目（13BZ012）。

李羚（1963-），女，云南会泽人，教授，liling-bs@163.com。