辣木叶总黄酮响应面法微波萃取工艺优化及其体外降糖效果观察

吉莉莉，汪开毓*，罗晓波，赵 玲，黄小丽，周 燕

1 四川农业大 学动物医学院动物疫病与人健康四川省重点实验室，雅安 625014;2四川省自然资源科学研究院，成都 610015

辣木(Morniga oleifera Lam.)为辣木科、辣木属植物，起源于印度北部的亚喜马拉雅山地带。印度和非洲国家常用于治疗糖尿病、高血压、心血管病、肥胖症等疾病［1，2］。近年来，辣木在我国广东、云南、海南等都有引种栽培。2012 年辣木叶被中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会批准为新资源食品。目前国内外对辣木叶提取物的研究，证明了辣木叶黄酮类化合物有降低糖耐量、降血糖、降血脂等作用［3-6］。

已报道的辣木叶黄酮提取有乙醇为溶剂的回流提取法，耗时长，效率较低，且仅采用正交法优化提取工艺［7，8］。微波萃取法用于黄酮类化合物提取时，具有选择性高、节省时间、溶剂用量少，对环境安全无害，提取效率高等优点［9］。响应面法与正交法相比，能研究几种因素的交互作用，越来越广泛地运用在解决多变量问题［10］。为此，本文以响应面法优化辣木叶总黄酮提取工艺，并观察回流提取与微波萃取总黄酮的体外降糖效果差异，为辣木叶资源开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

辣木叶粉，购自云南景洪云南省热带作物科学研究所，石油醚8 h 索氏回流去脂;芦丁，购自中国生物制品检定所;DMEM 高糖培养基，购自Thermo生物化学制品(北京)有限公司;四甲基偶氮唑盐(MTT)，购自Sigma 公司;胎牛血清，购自Thermo 生物化学制品(北京)有限公司;葡萄糖试剂盒，购自南京建成生物工程研究所有限公司;HepG2 细胞株，中国科学院成都生物研究所天然产物中心惠赠。

电脑微波超声波紫外光组合催化合成仪，北京祥鹄科技发展有限公司XH-300UL 型;紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司，UV-1100 型;酶标仪，BIO-RAD680 型;旋转蒸发仪，德国IKA RV05 型。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的建立

按照陈瑞娇［7］的方法建立芦丁对照品标准曲线。

1.2.2 回流提取辣木叶总黄酮及含量测定

按上法，准确称取样品30 g，加入70%乙醇，液料比20∶1，60 ℃回流提取3 次，每次1h。提取液滤过，合并滤液，即得回流提取总黄酮(Flavones extract by Reflux Extraction，FRE)。冷却至室温后，取滤液1 mL，测定总黄酮浓度。

1.2.3 微波萃取辣木叶总黄酮及含量测定

准确称取样品，按试验设计的条件加入溶剂，置微波提取仪中，仪器设定为微波功率恒定模式，磁力搅拌。反应完成后滤过，即得微波萃取总黄酮(Flavones extract by Microwave Extraction，FME)。冷却至室温后取滤液1 mL，按上法测定总黄酮浓度。

1.2.4 响应面法优化实验

在单因素实验的基础上，以乙醇浓度、微波功率、提取时间、液料比等因素为考察变量，以总黄酮得率F 为响应值，应用Design-Expert8.0.6 软件，优化微波提取辣木叶总黄酮的工艺条件。响应面分析因素与水平设计见表1。

表1 响应面分析因素水平Table 1 Factors and levels of response surface design

1.2.5 辣木叶总黄酮体外降糖实验［11］

1.2.5.1 细胞培养

将HepG2 细胞接种于培养瓶中，加入含10%热灭活胎牛血清、100 U/mL 青霉素-链霉素双抗的DMEM 高糖培养液，置37C、5% CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养。每隔2 d 更换1 次培养液，3 d后传代，传代数1∶4。取对数生长期的细胞进行试验。

1.2.5.2 FRE 和FME 对HepG2 细胞葡萄糖消耗作用及MTT 毒性试验

将冷冻干燥的FRE 和FME 粉末配制成高浓度水溶液，微孔滤膜滤过后，用无血清DMEM 培养液稀释至所需浓度待用。将处于良好生长状态的HepG2 细胞，用0.25%胰蛋白酶液消化后，以1×105个/mL 细胞接种于96 孔培养板中，置于CO2培养箱中培养，待细胞贴壁后，弃去原培养液，换无血清培养液饥饿12 h 后，加入含样或不含样的高糖培养液。将96 孔培养板中细胞分为空白对照组、样品组，每个组重复6 孔，孵育24 h 后用葡萄糖试剂盒(氧化酶法)测定各孔培养液中葡萄糖的浓度，采用式(2)计算葡萄糖的消耗量。

式(2)中，GC:葡萄糖的消耗量，mmol/L;G0:0 h培养液中葡萄糖浓度，mmol/L;G24:24 h 培养液中葡萄糖浓度，mmol/L;

同时进行MTT 毒性试验，在葡萄糖消耗试验孵育结束，按文献［11］方法测定细胞存活性与数量。

1.3 统计学分析

数据以SPSS19.0 软件分析，各组间差异采用LSD 分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

根据各浓度芦丁对应的吸光值，计算得到标准曲线C=0.0817A+0.0018，相关系数R2=0.9998。

2.2 回流提取辣木叶黄酮得率

回流后的提取液滤过，总黄酮得率为2.05%，与陈瑞娇的结果3.59%差异较大，可能因种植地点、采摘时间、烘干方式不同等因素造成。

2.3 单因素实验

2.3.1 乙醇浓度的影响

称取5 份辣木叶粉，每份1g，于微波萃取仪中提取。分别加入50%、60%、70%、80%、90%乙醇，微波功率200 W，提取时间6 min，液料比50∶1，结果见图1a。由图1a 可见，乙醇体积分数在60%时，提取率最大，而乙醇浓度增加，提取率降低，这是因为黄酮糖苷是由甙元成分和糖组成，甙元成分不易溶于水，而糖又易溶于水，乙醇与水达到最佳比例时，提取量最大。所以选择体积分数为60%。

2.3.2 提取时间的影响

称取5 份辣木叶粉，每份1 g，加入60%乙醇，微波功率200 W，液料比50∶1，分别按提取时间6、8、10、12、14 min。结果见图1b。由图1b 可见，随时间延长，总黄酮得率升高，当提取时间为8 min 时，达到最高，低于8 min 时，提取不完全，而高于8 min时，由于温度随时间升高，部分黄酮类化合物可能被破坏，而导致得率下降。因此，选择提取时间为8 min。

2.3.3 微波功率的影响

称取5 份辣木叶粉，每份1 g，加入60%乙醇，液料比50∶1，分别于微波功率100、200、300、400、500 W，提取8 min。结果见图1c。由图1c 可见，随着提取功率增加，总黄酮得率增加，功率达到400 W时最高，高于400 W 时则下降。这可能是过高功率对黄酮类化合物活性成分产生破坏导致得率下降。因此，选择提取功率为400 W。

图1 乙醇浓度(a)、提取时间(b)、微波功率(c)及液料比(d)对总黄酮得率的影响Fig.1 Effects of ethanol concentration(a)，extraction time(b)，microwave power(c)and liquid-to-solid ratio(d)on the extraction yield of flavones

2.3.4 液料比的影响

称取5 份辣木叶粉，每份1 g，分别按照30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1 加入60%乙醇，微波功率400 W，提取8 min，结果见图1d。由图1d 可见，当液料比为60∶1 时，总黄酮得率最高。因为液料比不足时，微波加热速度快，温度过高，破坏黄酮类化合物;过高时，微波加热时间增长，未达到提取最佳温度或保持时间不足使提取不完全。因此选择液料比为60∶1。

2.4 响应面法对辣木叶总黄酮微波提取工艺参数的优化

试验方案及结果见表2

将所得试验数据进行多元回归拟合，得到辣木叶黄酮得率Y 与微波提取各因素变量的二次回归方程模型为:

表2 响应面试验方案与结果Table 2 Design and results of response surface analysis

各因素按影响大小排序为微波功率X2＞醇浓度X1＞提取时间X3＞液料比X4。为了检验方程的有效性，对微波提取总黄酮的数学模型进行方差分析，并对各因子的偏向回归系数进行检验，结果见表3。

由表3 可见，该模型极显著(P＜0.0001);方程一次项中醇浓度X1为影响极显著(P＜0.001)，提取时间X3为影响高度显著(P＜0.01)，其余为不显著(P＞0.05);方程二次项因素均为影响极显著(P＜0.001);交互项X1X2、X1X4为影响显著(P＜0.05)，X2X3、X2X4为影响高度显著(P＜0.01)，X1X3、X3X4为不显著。模型失拟项(P=0.1049)表示模型选择合适。同时回归方程相关系数R2=0.9852，说明模型相关度很好。所以，可以使用该模型来分析响应值的真实变化，可以用其确定最佳提取工艺条件。

表3 回归模型参数检验Table 3 Parameter estimate of regression model

为了进一步研究相关变量交互作用以及确定最优点，通过Design Expert8.0.6 软件绘制响应面曲线图进行可视化分析。结果见图2。由响应面立体图可知，响应值存在最大值，经软件分析计算，得到辣木叶总黄酮的最佳提取条件:醇浓度58.45%，微波功率397.15 W，提取时间8.13 min，液料比59∶1，理论提取率为3.49%。对该条件下进行5 次验证试验，结果表明，总黄酮平均得率为3.45%，试验结果与模型基本相符，说明该模型能较好地模拟和预测辣木叶总黄酮得率。微波萃取与回流提取相比，总黄酮得率由2.05%升至3.45%，增加了68.3%;提取时间由3 h 缩短至8 min，仅为回流提取的4.44%。主要是因为微波萃取是利用微波使细胞内部的温度迅速升高，压力增高使细胞破裂，药材内有效成分流出，并在较低的温度下溶于萃取液，使提取时间更短，提取率更高［12］。

2.5 辣木叶总黄酮体外降糖试验

2.5.1 FRE 和FME 对HepG2 细胞增殖的影响

以空白对照为100%计算，细胞存活率如图3所示。MTT 毒性试验表明，FME 与FRE 浓度在0.125 mg/mL 时，对细胞增殖有一定影响，存活率分别为99.47%及99.90%，其余浓度细胞存活率均大于100%，表现为促进细胞增殖。提取物冻干粉末相同质量浓度下，FRE 组细胞存活率均高于FME 组。

图2 不同变量交互作用对总黄酮得率影响的响应面和等高线图Fig.2 Response surface plot and contour line of factors interaction on extraction yield of total flavones

图3 FME 及FRE 的细胞毒性Fig.3 Toxicity of FME and FRE

表4 FRE 和FME 对HepG2 细胞葡萄糖消耗作用Table 4 The effect of FRE and FME on the glucose consumption of HepG2 cell

2.5.2 FRE 和FME 对HepG2 细胞葡萄糖消耗的作用

由表4 可见，三个浓度的辣木叶黄酮提取物均有增加细胞对葡萄糖的消耗作用，并且与空白对照组相比，用药组的葡萄糖消耗量显著增加(P＜0.05)。用MTT 校正，扣除细胞增殖抑制对培养液中葡萄糖消耗的影响后，均显著增加单位细胞的葡萄糖消耗量。相同质量浓度时，由FME 比FRE 表现出更强的降糖活性，说明了微波萃取方法可能提取的降糖有效成分含量更高。

3 结论

本研究采用微波萃取法提取辣木叶总黄酮，对提高辣木叶总黄酮的综合利用以及黄酮类化合物的产业化具有理论指导意义。通过响应面分析对其提取工艺进行优化，微波萃取的最优提取工艺为:乙醇浓度58%，微波功率397 W，提取时间8 min，液料比59∶1(mL/g)。在此条件下，辣木叶总黄酮得率为3.45%。该方法传统的回流提取相比，具有耗时短，提取率高的优势。

辣木叶黄酮能促进HepG2 细胞对葡萄糖的消耗，与空白组相比具有明显降糖效果，而微波萃取得到的总黄酮比回流提取得到的总黄酮表现出更强的降糖活性。提示微波萃取法能不仅缩短提取时间，且能提高辣木叶中降糖活性成分的提取率。

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