竹林土壤中纤维素降解菌的筛选及产酶条件优化

蒋玉俭，李新鑫，孙飞飞，余学军

（浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，浙江 临安 311300）

竹林土壤中纤维素降解菌的筛选及产酶条件优化

蒋玉俭，李新鑫，孙飞飞，余学军

（浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，浙江 临安 311300）

为了寻找较为高效的纤维素降解菌，以便更好利用纤维素资源，结合分析被刚果红染色后形成的透明圈大小以及羧甲基纤维素酶活力强弱，从浙江省临安市竹林土壤中分离筛选出1株高效纤维素降解菌J6-1。经形态学观察初步鉴定该菌株属于青霉属Penicillium。对该菌株的液态发酵产酶条件和产酶稳定性进行研究。结果表明：最佳产酶条件是以15.0 g·L-1稻草粉作碳源、以3.0 g·L-1酵母膏为氮源，10%接种量，pH 5.0，40℃发酵培养5 d。经优化后菌株J6-1最高羧甲基纤维素钠酶活和滤纸酶活分别达到了41.82×16.67 μkat·L-1和17.26×16.67 μkat·L-1，并且经5次传代培养，酶活力仍得到保持。青霉J6-1可用作进一步实际应用研究的试验菌株。图3表3参34

森林微生物学；纤维素降解菌；筛选；产酶条件；优化

纤维素是自然界中分布最广、储量最丰富的可再生有机资源［1］，占植物干质量的35%～50%［2］，在碳循环中有着重要作用［3］，其全球累积量为1012t·a-1以上［4-5］。然而，纤维素具有不溶于水和难以降解的特性，使得如此庞大的纤维素类资源并未被充分利用。目前，中国的纤维素类资源主要用于燃烧，能量利用率非常低（10%左右）［6］。另外，一些未及时处理的纤维类资源则变成固体垃圾，造成严重的环境污染。所以，如果使用适当处理方法将这些可再生的纤维素降解为便于利用的糖液，再进一步转化为具有商业价值的产品，如乙醇［7］、单体蛋白［8-9］以及有机酸［10］等，这对解决人类所面临的能源危机、食物短缺和环境污染等问题具有重大意义［11-12］。过去处理纤维素主要采用酸［13］、碱［14］以及蒸汽加热［15］等方法，但这些方法存在一些缺点，例如条件要求高、产物回收率不高和废弃物存在二次污染等。目前，较有效且接近自然的纤维素处理方法就是利用微生物产生的纤维素酶来降解纤维素，其具有反应条件温和、产物产率高和无二次污染等优点。纤维素酶是一种能降解纤维素生成葡萄糖的复合酶，其完整酶系主要包括内切葡聚糖酶（EC 3.2.1.4），外切葡聚糖酶（EC 3.2.1.91），β-葡萄糖苷酶等3类酶［16］，其中，内切葡聚糖酶用于降解纤维素分子内部β-1,4-糖苷键，形成大量小分子纤维；外切葡聚糖酶用于降解纤维素分子末端β-1,4-糖苷键，生成纤维二糖；β-葡萄糖苷酶用于降解纤维二糖生成葡萄糖。催化纤维素水解需要一个完整的纤维素酶系相互协同作用。因此，分离和筛选出具有较完整纤维素酶系的菌株非常重要。以往许多研究筛选的纤维素降解菌来自树林土壤和动物肠道等，如刘清锋等［17］从稻田腐烂秸秆中分离筛选出降解纤维素能力较强的青霉Penicillium T24-2；Sheng等［18］从暗黑鳃金龟Holotrichia parallela的肠道中筛选出1株高纤维素酶活力的假单胞菌Pseudomonas HP207，对从竹林土壤分离纤维素降解菌的研究较少。实际上，竹林土壤富含纤维素，生活着大量不同种类的纤维素降解菌，是高效纤维素降解菌的理想来源地。因此，本实验从浙江省临安市竹林中采集土样，利用羧甲基纤维素选择培养基分离筛选出1株纤维素降解能力较强的菌株J6-1，并对其进行了菌种的初步鉴定及产纤维素酶条件优化。

1 材料与方法

1.1 培养基

富集培养基（液体）：羧甲基纤维素钠（CMC-Na）15.0 g，磷酸二氢钾（KH2PO4）1.0 g，氯化钠（NaCl）0.1 g，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.3 g，硝酸钠（NaNO3）2.5 g，氯化铁（FeCl3）0.01 g，氯化钙（CaCl2）0.1 g；定容至1.0 L，自然pH值。

选择培养基（固体）：羧甲基纤维素钠（CMC-Na）15.0 g，磷酸二氢钾（KH2PO4）1.0 g，氯化钠（NaCl）0.1 g，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.3 g，硝酸钠（NaNO3）2.5 g，氯化铁（FeCl3）0.01 g，氯化钙（CaCl2）0.1 g，琼脂15 g；定容至1.0 L，自然pH值。

种子培养基：PDA培养基（马铃薯200.0 g，蔗糖20.0 g，琼脂15.0 g，水1 000.0 mL，自然pH值）。

液体发酵培养基：羧甲基纤维素钠（CMC-Na）15.0 g，磷酸二氢钾（KH2PO4）1.0 g，氯化钠（NaCl）0.1 g，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.3 g，硝酸钠（NaNO3）2.5 g，氯化铁（FeCl3）0.01 g，氯化钙（CaCl2）0.1 g；定容至1.0 L，自然pH值。

1.2 菌株的分离筛选

1.2.1 样品采集 实验样品（不同程度腐烂的砻糠、稻草、竹叶以及土壤）来自杭州市余杭区和临安市各村的竹林（雷竹Phyllostachys violascens林和毛竹Phyllostachys edulis林）。采用5点取样法［19］取0～5 cm土壤混合样品200.0 g，将采集的样品装到无菌袋中并编号，放入冰盒中带回实验室4℃保存。共采集到20个样品。

1.2.2 富集培养 称取10.0 g样品加到90.0 mL富集培养基中，30℃，120 r·min-1培养3 d后取培养液以体积为5%的接种量接入新的富集培养基中，再反复富集2次［20］。

1.2.3 菌株的筛选分离 取1.0 mL富集菌液依次稀释成比例梯度为10-1，10-2，10-3，10-4，10-5和10-6，再分别从中取0.1 mL涂布到羧甲基纤维素钠培养基（CMC-Na平板）上，30℃恒温箱培养3 d后，挑取单菌落分别点种3个CMC-Na平板上（即3次重复）于30℃恒温箱培养6 d，用1.0 g·L-1刚果红溶液对平板染色30 min，再用1.0 mol·L-1氯化钠溶液浸洗2次（每次30 min），然后采用十字交叉法测量CMC-Na平板上透明圈直径（D，mm）和菌落直径（d，mm），选取Hc值（Hc=D/d，即透明圈直径与菌落直径的比值）较大且快速生长的菌落进行划线分离纯化并保存［18-21］。

1.3 粗酶液的制备

将筛选到的菌株分别接种到种子培养基中，30℃，150 r·min-1培养3 d，再以10%的接种量接入装有50.0 mL发酵产酶培养基的250.0 mL三角瓶中，30℃，150 r·min-1下培养，5 d后，取5.0 mL发酵液，于4℃，5 000 r·min-1离心10 min，所得的上清即为粗酶液［22］。

1.4 酶活力测定方法

1.4.1 羧甲基纤维素酶活力（CMCase）的测定 取粗酶液0.1 mL加入1.9 mL质量分数为1%羧甲基纤维素钠的柠檬酸缓冲液（pH 4.8，0.05 mol·L-1），以沸水浴灭活的粗酶液反应作为对照，50℃恒温水浴30 min后，加入2.0 mL DNS显色液，沸水浴显色10 min后，冷水浴快速冷却停止反应，然后定容至25 mL，于540 nm波长测定其吸光度D（λ）值。上述条件下，定义1 h 1.0 mL酶液催化底物水解生成1.0 μmol葡萄糖所需的酶量为1个酶活单位（U）［23］（1 U=16.67 nkat）。

1.4.2 滤纸酶活力 （FPAase）的测定 取粗酶液0.1 mL加入50.0 mg（1.0 cm×6.0 cm）折叠成M型的Whatman滤纸条，再加入1.9 mL柠檬酸缓冲液（pH 4.8，0.05 mol·L-1），以沸水浴灭活的粗酶液反应作为对照，按DNS法测定还原糖。

1.5 菌株的初步鉴定

观察菌落和菌体形态特征，参照《真菌鉴定手册》［24］和《中国真菌志》［25］对菌株进行形态学鉴定。

1.6 产酶条件优化

以液体发酵培养基作为基础配方，选择不同氮源（酵母膏、尿素、硝酸钠、硝酸铵、蛋白胨），碳源（羧甲基纤维素钠、竹粉、滤纸、稻草粉、蔗糖、葡萄糖），接种量（1%，5%，10%，15%，20%），初始pH值（3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0），培养温度（20，25，30，35，40，45，50℃），培养时间（1，2，3，4，5，6，7 d）进行单因素实验，进而通过正交实验确定目标菌株的最佳产酶条件。

2 结果与分析

2.1 纤维素降解菌的筛选

从竹林腐殖土壤中初步筛选获得26株经刚果红染色后能够产生透明水解圈的菌株，再测定羧甲基纤维素酶活力进行复筛，5株较好菌株结果见表1，其中菌株C2-2拥有较大Hc值为2.96，其5 d发酵培养后的羧甲基纤维素酶活力仅4.43×16.67 μkat·L-1明显低于菌株J6-1的6.87×16.67 μkat·L-1，故确定最佳纤维素降解菌株为J6-1。

表1 5株菌的Hc值及羧甲基纤维素酶活力大小Table1 Hcvalues and cellulase activity of 5 strains

2.2 菌株J6-1的生物学特征

图1 菌株J6-1的形态学特征Figure 1 Morphological characteristic of strain J6-1

菌体形态特征见图1，菌株J6-1在羧甲基纤维素固体培养基上生长时，菌落呈絮状，中心脐状突起边缘整齐，初期为浅绿色，后期呈灰绿色，在40倍显微镜下观察到该菌株的分生孢子近球形，分生孢子梗从菌丝垂直长出，排列成扫帚状的间枝着生于其顶端。可初步判断该菌株为青霉属Penicillium。

2.3 菌株J6-1发酵条件优化

2.3.1 氮源对菌株产酶活力的影响 分别以酵母膏、尿素、硝酸钠、硝酸铵、蛋白胨为氮源进行发酵实验。结果如图2A所示：氮源对菌株的产酶能力的影响较大，使用有机氮时的酶活明显高于使用无机氮。这表明菌株J6-1能较好利用有机氮。当用酵母膏作氮源时，菌株J6-1纤维素酶活力最高，羧甲基纤维素酶活力达到16.62×16.67 μkat·L-1，滤纸酶活达到3.76×16.67 μkat·L-1。因此选用酵母膏作为最佳氮源。

2.3.2 碳源对菌株产酶活力的影响 分别以羧甲基纤维素钠、竹粉、滤纸、稻草粉、蔗糖、葡萄糖为碳源进行发酵实验。结果如图2B所示：不同碳源条件下酶活力存在较大差异，当以稻草粉作唯一碳源时，菌株J6-1的羧甲基纤维素酶活与滤纸酶活均达到最大值，分别为20.73×16.67 μkat·L-1和8.20×16.67 μkat·L-1。当以滤纸作为碳源时，酶活力最低。稻草主要含有纤维素、半纤维素、果胶、木质素粗蛋白等物质，对菌株产酶有较好诱导作用［26］。故最佳碳源为稻草粉。

2.3.3 不同接种量对菌株产酶活力的影响 在最优碳源、氮源条件下，分别接种1%，5%，10%，15%和20%种子液进行发酵实验。结果如图2C所示：接种量不同对酶活力有较大影响。当接种量为10%时，羧甲基纤维素酶活力最高；当接种量增加到20%时，酶活力明显下降；这表明接种量过大，菌体大量生长，占用更多空间和资源，导致菌株产酶减少，最终选定最适接种量为10%。

图2 氮源（A），碳源（B），接种量（C）对菌株J6-1产酶活力的影响Figure 2 Effect of different nitrogen sources,carbon sources and inoculation quantity on cellulase activity of strain J6-1

2.3.4 不同pH值对菌株酶活力的影响 在最优碳源、氮源条件下，调整初始pH值分别为pH 3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0和9.0接种10%种子液进行发酵实验。结果如图3A所示：培养基pH值对菌株J6-1酶活力影响较大，滤纸酶活变化趋势与羧甲基纤维素酶活变化趋势保持一致；随着pH值升高，菌株J6-1酶活力呈现先增大后减小趋势。当pH值从pH 3.0升高到pH 5.0时，羧甲基纤维素酶活力由8.85×16.67 μkat·L-1快速增加到最大酶活25.39×16.67 μkat·L-1，滤纸酶活从3.15×16.67 μkat·L-1增加到10.41×16.67 μkat·L-1；之后再升高pH值，羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活力均降低。在pH 5.0时，羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活均表现出最佳酶活力，说明菌株最佳发酵培养的酸碱度为pH 5.0。

2.3.5 不同温度对菌株产酶活力的影响 在最优碳源、氮源、pH 5.0条件下，调整培养温度分别为20，25，30，35，40，45和50℃接种10%种子液进行发酵实验。结果如图3B所示：随着温度升高，菌株酶活力先增大后急剧下降，说明培养温度对菌株J6-1发酵产酶影响较大，较低或较高温度均不利于产酶，在40℃的培养温度下，羧甲基纤维素酶活最大为34.57×16.67 μkat·L-1；然而，当温度为35℃时，滤纸酶活达到最高为14.36×16.67 μkat·L-1，因此，菌株J6-1最佳培养温度范围为35～40℃。

2.3.6 培养时间对菌株产酶活力的影响 在最优碳源、氮源、pH 5.0，40℃条件下，接种10%种子液进行发酵实验，分别取1～7 d发酵液进行酶活力测定。结果如图3C所示：滤纸酶活变化趋势与羧甲基纤维素酶活变化趋势保持一致；菌株J6-1经过2 d发酵培养后，酶活迅速提高；当发酵培养5 d时，菌株J6-1的羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活均达到最大值，分别为36.57×16.67 μkat·L-1和15.42×16.67 μkat·L-1；继续加长培养时间，可能由于菌株生物量达到饱和营养供应不足，菌株J6-1产酶酶活逐渐减弱。因此，最佳取样时间为5 d。

图3 初始pH（A）,培养温度（B）和培养时间（C）对菌株J6-1产酶活力的影响Figure 3 Effect of initial pH,temperature and time on cellulase activity of strain J6-1

2.3.7 正交优化菌株J6-1产酶条件 根据以上单因素实验结果，采用正交法去确定菌株J6-1最佳培养条件。选择稻草粉量、酵母膏量、培养温度、培养时间4个因素，每个因素取3个水平进行L9（34）正交实验，培养条件为10%接种量、初始pH 5.0，150 r·min-1液体摇瓶发酵。实验结果如表2所示：各因素对菌株J6-1产酶影响大小依次是稻草粉量、酵母膏量、培养时间、培养温度，在6号实验条件下，其羧甲基纤维素酶活力和滤纸酶活力分别为40.59×16.67 μkat·L-1和16.43×16.67 μkat·L-1。正交实验表明最佳培养条件为A2B3C2D2，即15.0 g·L-1稻草粉、3.0 g·L-1酵母膏、40℃培养5 d。

表2 L9（34）正交实验设计及分析Table2 Design and results analysis of L9（34）orthogonal test

2.4 菌株J6-1酶活稳定性研究

将已筛选到的菌株J6-1进行连续5代传代培养，然后最佳条件发酵培养测定其每代菌株羧甲基纤维素酶活力和滤纸酶活力。结果如表3所示：各子代菌株均能较好延续原代菌株酶活力，羧甲基纤维素酶活力和滤纸酶活力分别维持在41.82×16.67 μkat·L-1和17.26×16.67 μkat·L-1左右。

表3 菌株J6-1传代酶活力Table3 Cellulase activity of Strain J6-1 passage

3 讨论与结论

本研究采用透明圈初筛、酶活测定复筛的方法，从竹林土壤中分离出1株高效纤维素降解真菌，通过生物学观察初步鉴定该菌株为青霉菌属Penicillium。然后测定了该菌株的羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活，并进一步对该菌株的发酵产酶条件进行了优化；结果表明：在添加15 g·L-1稻草粉、3 g·L-1酵母膏作碳源和氮源，10%接种量，pH 5.0，40℃，150 r·min-1发酵培养5 d条件下，该菌株获得最佳羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活，分别为41.82×16.67 μkat·L-1和17.26×16.67 μkat·L-1。

目前，已经筛选出不同种类降解纤维素的细菌［27］、放线菌［28］和真菌［29］。这些筛选到的降解纤维素材料的活性微生物普遍被应用于生物质能源发酵工艺（替代能源的生产）［30］、饲料生产［31］和秸秆还田土壤培肥［32］等方面。本研究筛选到的菌株来自竹林土壤，不仅可应用于以上研究，在竹林土壤生长环境也具有独特优势［33］，更适合用于制作促竹林有机物降解菌制剂，不会引入外来菌株而造成二次污染。

在纤维素酶活的研究中，滤纸酶活通常被用来表征3种酶组分协同作用后的总酶活［34］。本实验筛选到的青霉菌J6-1经优化后其滤纸酶活力可到达17.26×16.67 μkat·L-1，高于可晓等［22］从雷竹林土壤中筛选到的青霉菌2.1（滤纸酶活为11.19×16.67 μkat·L-1），对纤维素降解效果更好。其次，该菌株最佳产酶pH 5.0，温度为40℃，表现出一定的耐酸能力，能适应自然界高温环境，这对于其实际应用具有重大意义。

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Screening of a cellulose-decomposing strain from bamboo stand soils and optimization of its cellulase production

JIANG Yujian,LI Xinxin,SUN Feifei,YU Xuejun
（The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China）

Cellulose,the most extensive and abundant renewable resource in nature with an annual worldwide accumulation of photosynthetic plant cellulose materials of 1012t of which an estimate of 89%has been used unreasonably （such as in direct burning）,should be produced by more effective cellulolytic microorganisms to transform these renewable resources into available energy.At present,although important research about screening cellulolytic microorganisms has been conducted,few studies on isolating and screening cellulose-decomposing microorganisms from bamboo stand soils have been described.This research isolated and screened efficient cellulolytic microorganisms from bamboo stand soils based on the size of transparent circles and the activity of carboxymethyl-cellulase （CMCase）.An efficient cellulose-decomposing fungus,J6-1,was obtained and preliminary morphological observation identified it as Penicillium（Strain J6-1）.On the basis of single-factor experiments,the orthogonal experiment of 4 factors at 3 levels was then taken to optimize the liquid fermentation conditions conditions of cellulase production.And the hereditary stability of cellulase produced Strain J6-1 was evaluated by the cellulase activity analysis of 5 consecutive generations.Experimental results showed that the optimum conditions for cellulase production were as follows:15.0 g·L-1straw powder as carbon, 3.0 g·L-1yeast extract as a nitrogen source,a 10%inoculation quantity,fermentation at 40℃,and an initial pH of 5.0 for 5 d.After optimization of strain J6-1,the highest activity of carboxymethyl-cellulase（CMCase）was 41.82×16.67 μkat·L-1and filter paper enzyme activity（FPAase）was 17.26×16.67 μkat·L-1.Thus,these characteristics of high cellulose activity could be subcultured serially,and strain J6-1 could be used for furtherpractical application.［Ch,3 fig.3 tab.34 ref.］

forest microbiology;cellulose-decomposing microorganisms;screen;enzyme production;optimization

S718.8

A

2095-0756（2015）07-0821-08

浙 江 农 林 大 学 学 报，2015，32（6）：821-828

Journal of Zhejiang A＆F University

10.11833/j.issn.2095-0756.2015.06.001

2015-01-08；

2015-03-09

浙江省科学技术重点项目（2012T201-05）

蒋玉俭，从事竹林培育与利用研究。E-mail：jiangyujian.2009@163.com。通信作者：余学军，副研究员，从事竹子栽培与利用研究。E-mail：yuxj@zafu.edu.cn