新牧1号苜蓿抗逆相关基因MvNHX1启动子表达载体的构建

代文俊，朱彦卓，晁朝霞，任燕萍

（新疆农业大学农业生物技术重点实验室，新疆农业大学农学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

新牧1号苜蓿抗逆相关基因MvNHX1启动子表达载体的构建

代文俊，朱彦卓，晁朝霞，任燕萍

（新疆农业大学农业生物技术重点实验室，新疆农业大学农学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

为了进一步研究新牧1号苜蓿抗逆相关基因Mv N H X1启动子的功能，采用双酶切的方法，用核酸内切酶S acⅠ和N c oⅠ分别双酶切p C AM B IA1304质粒和阳性重组质粒p E A S Y-T1-simple-pMv N H X1，然后回收目的片段。通过T4DN A连接酶将目的片段和空载体相连后获得连接产物。将连接产物导入到宿主菌D H5α，通过画板，卡那霉素筛选后挑单菌落摇菌。然后用菌液PC R及双酶切鉴定该载体后，用冻融法将其导入农杆菌E H A105。结果表明，成功培养出含有抗逆相关基因Mv N H X1启动子pMv N H X1∶G U S∶E H A105的菌落；成功构建出新的植物表达载体pMv N H X1∶G U S。

诱导型启动子；Mv N H X1启动子；表达载体构建

启动子在基因表达调控过程中起着重要作用[1]。植物基因启动子的克隆及其功能的研究有助于了解基因表达调控模式和信号传递途径，同时可应用于基因工程中调控目的基因的表达。目前植物基因工程中广泛应用的组成型启动子能高效、非特异地启动外源基因表达，外源基因在组成型启动子的调控下在植物的所有生长发育阶段和所有组织中都高效表达，但是这往往会造成植物的代谢负荷，从而影响植物的长势和产量。因此，由于信号刺激而具有转录活性的诱导型启动子和能够驱动外源基因在植物组织器官中定时、定点表达的组织特异性启动子已逐渐成为研究的热点[2-3]。

以成功克隆的新牧1号苜蓿抗逆相关基因M vNHX1启动子为研究对象[4]，采用分子生物学研究方法，构建由M vNHX1启动子驱动的植物表达载体，为利用MvNHX1启动子驱动GUS基因的表达，进而了解M vNHX1启动子的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

植物表达载体pCAMBIA1304、大肠杆菌DH5α、农杆菌EHA105、限制性内切酶SacⅠ和NcoⅠ、T4DNA连接酶、胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、引物等。

1.2 试验方法

1.2.1 M vNHX1启动子目的片段获得 以含有目的片段的pEASY-T1-pMvNHX1质粒为模板，使用上游引物NS1（5’-CGAGCTCTTGGAAGCTGGCATGGAG GATG-3’）和下游引物NA1（5’-CATGCCATGGGG CAATGGGCACTGATGACTGG-3’）扩增得到带有SacⅠ和NcoⅠ双酶切位点的启动子片段，回收并纯化。

1.2.2 植物表达载体pMvNHX1:GUS构建 将植物表达载体pCAMBIA1304用SacⅠ和NcoⅠ双酶切，去除CaMV35S启动子片段。酶切后获得的MvNHX1启动子目的片段与酶切后的植物表达载体pCAMBI A1304进行连接反应，反应体系为25μL（10×T4Buffer为2.5μL，M vNHX1启动子目的片段为6μL，pCAMBIA1304目的片段为5μL，T4 DNA连接酶为1μL，加水至25μL），16℃反应25 h。将连接后的植物表达载体pMvNHX1:GUS转化到大肠杆菌中，涂抹于含有卡那霉素（50μg/m L）的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜，参照全式金质粒小提试剂盒说明书进行质粒DNA提取。使用菌液PCR和双酶切鉴定构建出的新的植物表达载体。

1.2.3 植物表达载体pM vNHX1:GUS转入农杆菌 首先活化农杆菌EHA 105至其OD600约为0.6，制备农杆菌感受态细胞，然后将重组质粒pMvNHX1::GUS转入进感受态细胞中，接种于YEB固体平板上（含50 μg/mL卡那霉素和50μg/m L利福平），28℃培养24 h，待平板长出单菌落后挑取摇菌，进行菌液PCR和双酶切鉴定。

2 结果与分析

2.1 植物表达载体的构建

用核酸内切酶 NcoⅠ和 SacⅠ分别双酶切pCAMBIA1304质粒和阳性重组质粒 pEASY-T1-simple-pMvNHX1。然后回收目的片段，将目的片段和空载体相连后获得连接产物。将连接产物导入到宿主菌Trans-T1，通过画板，卡那霉素筛选后挑单菌落，摇菌和提质粒，最终用内切酶NcoⅠ和SacⅠ进行单双酶切检测，双酶切产生约11 559 bp和1 378 bp的预期片段，单酶切产生约12 937 bp的预期片段（图1）。研究表明，MvNHX1启动子已成功插入到pCAMBI A1304上的多克隆位点，已成功构建出新的植物表达载体pM vNHX1:GUS。

图1 植物表达载体pMvNHX1:GUS酶切电泳结果注：M1，D15000DN A标准分子质量；1，pMv N H X1:G U S双酶切；2，pMv N H X1:G U S单酶切

2.2 含植物表达载体农杆菌阳性菌株的PCR检测

对转pMvNHX1:GUS的农杆菌质粒用MvNHX1启动子的特异引物扩增出预期大小的条带（图2）。说明植物表达载体pMvNHX1:GUS都已成功地转入到农杆菌EHA105菌株中。

图2 农杆菌pM vNHX 1:GUS转化子的PCR鉴定注：M，D2000DN A标准分子质量；1～3，Mv N H X1启动子PC R扩增产物

3 结论与讨论

以前期克隆得到的新牧1号苜蓿抗逆相关基因MvNHX1启动子为研究对象，采用分子生物学研究方法，成功构建获得由MvNHX1启动子驱动的植物表达载体pMvNHX1:GUS，为利用农杆菌介导法将MvNHX1启动子驱动GUS基因表达的植物表达载体转入烟草中，通过GUS化学组织染色分析不同胁迫处理下GUS表达活性，进而研究MvNHX1启动子的功能奠定基础。

前期研究结果表明，新牧1号苜蓿受高盐和干旱的诱导产生抗逆相关基因MvNHX1，因此，进一步采用基因工程技术，揭示新牧1号苜蓿MvNHX1诱导表达启动子生物学功能，其结果不仅可为苜蓿转基因工程提供可用的内源启动子，为苜蓿启动子研究奠定基础，而且可丰富和拓宽耐盐基因工程可用基因和启动子资源库，促进我国广大盐渍化地区的开发和利用。

[1]王 颖，麦维军，梁承邺，等.高等植物启动子的研究进展[J].西北植物学报，2003，23：2040-2048.

[2]杨春霞，陈 英，黄敏仁，等.拟南芥逆境诱导性启动子r d29A的克隆及活性检测[J].南京林业大学学报，2008，32（1）：6-10.

[3]杨 梅，熊立仲.水稻干旱诱导型启动子O s h o x24P的分离与鉴定[J].华中农业大学学报，2011，30（5）：525-531.

[4]杨云尧，任燕萍，苏豫梅，等.新牧1号苜蓿两个抗逆相关基因启动子的克隆及分析[J].草业科学，2012，29（12）：1887-1893.

（责任编辑：卢红玲）

Construction of Plant Expression Vector of M vNHX1 Promoter in M.varia Xinmu1

DAIWen-jun，ZHU Yan-zhuo，CHAO Zhao-xia，REN Yan-ping
（College of Agriculture,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,PRC;Key Lab of Agricultural Biotechnology, Xinjiang Agricultural University,Urumqi830052,PRC）

In order to clarify stress-inducible M vNHX1 promoter function in M edicago varia X inmu 1,the M vNHX 1 promoter and plant expression vector pCAMBIA1304 were digested w ith SacⅠand NcoⅠ by using co-digestion.Then the purified MvNHX1 promoter fragment was connected to the plant expression vector pCAMBIA1304 w ithout 35S promoter by T4 DNA ligase.Finally the pCAMBIA1304 containing M vNHX1 promoterwas successfully transferred into Agrobacterium tumefaciens EHA105.The transfered A. tumefaciens EHA105 w ith pM vNHX 1∶GUSwas identified by PCR and enzyme digestion.

inducible promoter;MvNHX1 promoter;construction of plantexpression vector

Q78

A

1006-060X（2015）01-0004-02

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.01.002

2014-10-24

新疆农业大学大学生创新项目（jqz tp72013009）

代文俊（1991-），女，河南沈丘县人，在读本科，主要学科专业为生物技术。

任燕萍