小鼠视网膜电图随生长发育的变化特点

梁厚成,马 挺,龙 潭,张红兵

·实验研究·

小鼠视网膜电图随生长发育的变化特点

梁厚成,马 挺,龙 潭,张红兵

目的:研究小鼠视网膜电图随生长发育的变化特点。

视网膜电图;小鼠;生长发育

引用:梁厚成,马挺,龙潭,等.小鼠视网膜电图随生长发育的变化特点.国际眼科杂志2015;15(11):1867-1870

0 引言

视网膜电图(electroretinogram,ERG)是视觉电生理检查项目中的一种,主要可用来检查视网膜功能,在各种视网膜病变的诊治及评估中有着重要的作用。对于儿童视网膜疾病及各种遗传性视网膜疾病的诊治,ERG亦有着重要的作用。然而儿童在出生后,视网膜并未发育成熟,随着年龄的增长,视网膜功能方可逐渐发育成熟,同时由于儿童视网膜中不同种类的细胞发育速度的不同[1],导致儿童的ERG与成年人相比有着不同的特征。小鼠因其95%以上的基因组与人类相同,并且可快速繁殖,在出生后2mo内即可达到性成熟,每胎可产仔8只以上,故其可作为多种疾病的模型动物。本文研究小鼠在发育过程中ERG的变化过程,以探讨小鼠视网膜发育过程及机制,以及遗传性视网膜疾病的发生、发展及治疗措施。

1 材料和方法

1.1 材料昆明种二级小鼠(购自第四军医大学动物中心),共50只(50眼),按观察的周龄分为5组,每组各10只10眼。所有小鼠在自然光线下饲养,不限食水。

1.2 方法[2]

1.2.1 实验仪器使用国特GT-2000NV(重庆国特医疗设备有限公司)记录ERG。刺激器为Ganzfeld全野刺激器。记录电极为自制Ag-AgCl环状角膜电极,参考电极和接地电极分别为不锈钢自制针状电极,各电极自身阻抗均小于10Ω。

1.2.2 实验方案及观察指标所有小鼠睁眼时间均在出生后12～13d。记录ERG的时间点为出生后14d (Postnatal 14 days,P14)、21d(Postnatal 21 days,P21)、28d (Postnatal 28 days,P28)、35d(Postnatal 35 days,P35)、56d (Postnatal 56 days,P56)记录ERG[2]。其中P56小鼠记录ERG作为成年小鼠的数据。2h暗适应后,使用速眠新(0.5～0.8mL/kg)进行腹腔注射麻醉,同时复方托品酰胺点检查眼4次,进行散瞳。在暗红光条件下放置电极。其中记录电极贴于角膜表面,并滴加生理盐水减少阻抗干扰,于左侧颊部皮下置入参考电极,同时接地电极置于尾部。电极安放好后,测试干扰在适当范围后,继续关灯暗适应5min,依次进行杆体ERG(Rod-ERG)、最大混合反应ERG(Max-ERG)、振荡电位(OPs)的记录。记录条件设置为:均为单次白色闪光刺激,1min间隔。其后在20cd/m2背景光下进行10min明适应,依次记录明适应ERG(Cone-ERG)、30-Hz闪烁ERG(Flick-ERG)。Cone-ERG为连续白光闪光刺激,共叠加10次,刺激频率为2Hz;Flick-ERG刺激光亦为白光,频率为30Hz,叠加约100次,直至波形平滑为止。Rod-ERG的刺激光强度为1.54×10-2(cd·s)/m2;其他ERG刺激光强度均为2.0(cd·s)/m2。振荡电位通频带为100～300Hz,其余各项均为1～100Hz。Flick-ERG自第2个正向波开始记录4个波,取其平均值作为其幅值。

统计学分析:所有数据的处理使用SPSS 10.0软件包进行单因素方差分析,并对两两间比较使用Dunnett T3分析。数据以95%可信区间表示,P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

在各周龄间Max-ERG a波、OPs O1波峰潜时及Flick-ERG幅值均无统计学差异;除P14和P28间Cone-ERG a波峰潜存在统计学差异外,其他各时间点无统计学差异;P14与P21、P28的Cone-ERG b波峰潜时分别存在统计学差异;而P14与其他各时间点间的Cone-ERG b波幅值、OPs O1、OPs O2波峰潜时和波幅值、Rod-ERG b波、Max-ERG b波均存在统计学差异(表1)。P14时,其中9只小鼠OPs的峰潜时较成年小鼠明显延长,而1只小鼠的OPs表现为只有1个波。P21时,OPs形成5～6个波。在生长期间,OPs各波峰潜时逐渐缩短,测量O2波数据作为OPs的值(图1)。在出生后各时间点之间Flick-ERG波幅值无统计学差异,但波形略有不同(图1)。

表1 小鼠ERG中部分参数随生长发育的变化

3 讨论

ERG是视网膜受到光线刺激后,节细胞之前各层细胞的电活动。ERG包括5个检查项目,各检查项目表示的视网膜细胞成分为:Rod-ERG:视杆细胞系统;Max-ERG:所有视杆和视锥系统;OPs:内核层;Cone-ERG:视锥系统及少量视杆系统;Flick-ERG(30Hz):视锥系统。而本研究以此标准对小鼠ERG的发育变化进行了初步的研究。

视网膜中包含有光感受器细胞、双极细胞、无长突细胞、Müller细胞等7种细胞,各种细胞发育成熟的时间并不一致[3]。很多物种视网膜在发育阶段经历两个阶段[4]。早期发育中,包括锥体细胞和神经节细胞等在内的部分细胞首先发育成熟;而在发育晚期,大部分的视杆细胞等细胞才发育成熟。小鼠视网膜[5]的发育也大致分为两个时期。从胚胎期第10d(E10)至胚胎期第14d(E14)为早期,而晚期则是从E17持续至出生后。视杆祖先细胞在有丝分裂停止后的5.5～12.5d,视杆细胞方才表达其特异性抗原Rhodopsin,这提示视杆细胞在出生后仍处于发育阶段[6-7]。另有研究显示视杆细胞的形态在出生后仍在发育,P10时内节已发育成熟,然而外节需到P21时才发育成熟[8]。同时视网膜各种细胞的程序性凋亡对于视网膜发挥正常的功能是非常重要的[9]。

本实验中,Rod-ERG b波在P21达到成年水平,而这个时间恰好是视杆细胞发育成熟的时间。有研究显示大鼠视杆细胞外节长度以及Rhodopsin水平与Rod-ERG b波有显著相关性[10]。因此Rod-ERG b波可能与视杆细胞、视杆双极细胞以及无长突细胞有关。

图1 小鼠在P14和P56的ERG。

既往的研究显示,光感受器细胞形成Max-ERG a波。本研究中,Max-ERG a波的峰潜时于P14已达到成年水平,而幅值达成年水平的时间则是P21,这可能提示视杆细胞和视锥细胞在接受光刺激后形成电活动的时间是一致的。Max-ERG b波于P21时达成年水平,而在P14时b波幅值较低。Wurziger等[11]认为ERG b波起源于on-双极细胞和第三级神经元(无长突细胞)。

P14时OPs O1波峰潜时已达成年水平,而幅值则于P21方达成年水平,这与Max-ERG a波相似。而OPs第二波群幅值和峰潜时均在P21时达到成年水平,与Max-ERG b波的发育时间相似。但通常认为产生这两种波形的细胞是不同的。在人类OPs中,各个波亦来自不同的细胞,其中杆体细胞系统可能形成O3和O4波[12-13]。本研究表明O1波达到成年水平的时间要早于第二波群,这亦可间接提示第二波群起源于视杆系统,而O1波则起源于视锥系统。

小鼠Cone-ERG无明显的a波,在出生后各时间点间b波峰潜时无统计学差异,而在P21时幅值方才达到成年水平。出生后各个时间点间Flick-ERG的幅值无统计学差异。既往研究显示产生Flick-ERG的细胞包括双极细胞以及光感受器细胞[14]。本研究间接证实视锥相关双极细胞在P14已经发育成熟,而在P14后视杆细胞继续发育可能导致了Cone-ERG b波幅值在P21方达成年水平。因此无长突细胞及双极细胞可能是产生Cone-ERG b波的细胞。Flick-ERG的波形在P14与成年时不同,提示视锥系统亦有继续发育的可能。

该研究结果间接证明了视网膜明视和暗视系统具有不同的发育时间点[3],并与人类不同发育时期的ERG相似[1]。本研究显示昆明种小鼠在不同发育阶段ERG波形不尽相同,在P21时ERG的各项参数已达到成年时的水平,其中在P14时视锥系统起源波形已达成年水平。因此记录小鼠ERG需考虑不同发育阶段对波形的影响。

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Changes of electroretinogram in mice with the growth and development of retina

Hou-Cheng Liang,Ting Ma,Tan Long,Hong-Bing Zhang

Department of Ophthalmology,Xi'an No.1 Hospital,Xi'an Eye Hospital,Xi'an 710002,Shaanxi Province,China

Foundation item:Subject of Xi'an Science and Technology Bureau (No.YF07136)

Tan Long.Department of Ophthalmology, Xi'an No.1 Hospital,Xi'an Eye Hospital,Xi'an 710002,Shaanxi Province,China.longtan1@sina.com

·AIM:To investigate the changes of electroretinogram in mice with the growth and development of retina.·METHODS:The ERG of 50 mice(50 eyes)of KUNMING at the ages of postnatal 14d(P14),P21,P28,P35 and P56 were measured respectively.The implicit times and amplitudes of b wave of Rod-ERG,a and b waves of Max-ERG,a and b waves of Cone-ERG and O1 and O2 waves of OPs at different ages,as well as amplitude of Flick-ERG,were compared.·RESULTS:The M ax-ERG a-waves(the 95%CI were 15.00～18.60,12.00～15.00,13.20～14.40,13.20～15.00, 13.20～15.00,respectively),OPs O1(the 95%CI were 15.00～19.80,13.80～18.00,13.20～14.40,13.80～15.60, 13.80～15.60,respectively)waves shared the implicit times at the different stages,and the Flick-ERG(the 95% CI were 0.97～3.28,0.85～2.32,0.91～3.49,0.94～2.68, 0.98～3.69μV,respectively)shared the amplitudes also. There was no significant difference among the weeks(P＞0.05).The implicit times of the Cone-ERG a-waves(the 95%CI were 25.20～55.20,27.00～40.20,27.00～38.40,25. 20～43.80,23.40～37.80,respectively)between P14 and P28 were distinct with statistical difference(P＜0.05).The implicit times of Cone-ERG b-waves(the 95%CI were 70.80～88.20,56.40～78.60,60.00～75.60,60.60～87.00, 62.40～81.60m s,respectively)at P14 were statistically different from those at P21 and at P28.The implicit times and amplitudes of Rod-ERG b-waves(the 95%CI were 87.00～114.00,53.40～73.80,52.2～63.6,55.20～71.40, 57.60～67.80m s,and 64.21～195.07,133.79～355.71,130. 62～355.96,190.92～448.97,239.26～462.40μV, respectively),Max-ERG b-waves(the 95%CI were 67.20～107.40,32.40～54.60,31.20～36.60,31.80～42.00,34.20～41.40m s,and 160.64～344.48,281.74～590.09,284.91～716.80,358.64～737.55,406.98～810.55μV,respectively), and OPs O2 waves(the 95%CI were 49.8～69.6,29.40～42.60,28.80～33.60,28.80～37.80,31.20～37.20m s,and 5.43～24.84,54.38～147.52,65.55～201.60,46.33～164.79,49.07～148.32μV,respectively)at P14 were different from those at other stages,and the amplitudes of OPs O1(the 95%CI were 11.60～21.36,6.77～53.71, 32.96～76.42,34.06～70.37,35.58～63.35μV, respectively)and Cone-ERG b-waves(the 95%CI were 5.10～15.85,9.61～24.88,14.96～40.73,14.87～28.54, 13.83～51.98μV,respectively)were from those at other stages also,and there were significant differences.The O1 wave of OPs had been present at P14,but the second cluster of OPs of one mouse(1/10)had not been obvious at the same time.·CONCLUSION:The experiment con firm sthat the different waves come from different cells in retina in mice at certain degree.Due to the change of the ERG in the development of mice,so it should be considered that the different development stages will affect the results when measuring the ERG of mice.

electroretiogram;mice;development

西安市科技局课题(No.YF07136)

作者单位:(710002)中国陕西省西安市第一医院眼科西安市眼科医院

梁厚成,毕业于第四军医大学,博士,主任医师,西安市眼科医院院长,研究方向:眼科临床。

龙潭,毕业于武汉大学,博士,副主任医师,西安市眼科医院白内障病区副主任,研究方向:白内障.longtan1@sina.com

2015-07-10

2015-10-23

:Liang HC,Ma T,Long T,et al.Changes of electroretinogram in mice with the growth and development of retina. Guoji Yanke Zazhi(Int Eye Sci)2015;15(11):1867-1870

10.3980/j.issn.1672-5123.2015.11.07

Received:2015-07-10 Accepted:2015-10-23

方法:我们分别测量50只50眼昆明种小鼠在出生后第14、21、28、35和56d视网膜电图,分析比较各时间点Rod-ERG b波、Max-ERG a及b波、Cone-ERG的a及b波、OPs O1及O2波幅值及峰潜时、Flick-ERG幅值。

结果:Max-ERG a波峰潜时(各时间点95%可信区间依次为15.00～18.60、12.00～15.00、13.20～14.40、13.20～15.00、13.20～15.00ms)、OPs O1波峰潜时(各时间点95%可信区间依次为15.00～19.80、13.80～18.00、13.20～14.40、13.80～15.60、13.80～15.60ms)和Flick-ERG幅值(各时间点95%可信区间依次为0.97～3.28、0.85～2.32、0.91～3.49、0.94～2.68、0.98～3.69μV)在各周龄间无统计学差异(P＞0.05);Cone-ERG a波峰潜时(各时间点95%可信区间依次为25.20～55.20、27.00～40.20、27.00～38.40、25.20～43.80、23.40～37.80ms)在出生后14d和28d间存在统计学差异(P＜0.05)、出生后14d与出生后21d、28d间Cone-ERG b波峰潜时(各时间点95%可信区间依次为70.80～88.20、56.40～78.60、60.00～75.60、60.60～87.00、62.40～81.60ms)均有统计学差异;同时出生后第14d与其他时间点间Rod-ERG b波峰潜时(各时间点95%可信区间依次为87.00～114.00、53.40～73.80、52.2～63.6、55.20～71.40、57.60～67.80ms)及幅值(各时间点95%可信区间依次为64.21～195.07、133.79～355.71、130.62～355.96、190.92～448.97、239.26～462.40μV)、Max-ERG b波峰潜时(各时间点95%可信区间依次为67.20～107.40、32.40～54.60、31.20～36.60、31.80～42.00、34.20～41.40ms)及幅值(各时间点95%可信区间依次为160.64～344.48、281.74～590.09、284.91～716.80、358.64～737.55、406.98～810.55μV)、OPs O2波峰潜时(各时间点95%可信区间依次为49.8～69.6、29.40～42.60、28.80～33.60、28.80～37.80、31.20～37.20ms)和波幅值(各时间点95%可信区间依次为5.43～24.84、54.38～147.52、65.55～201.60、46.33～164.79、49.07～148.32μV)以及OPs O1(各时间点95%可信区间依次为11.60～21.36、6.77～53.71、32.96～76.42、34.06～70.37、35.58～63.35μV)和Cone-ERG b波幅值(各时间点95%可信区间依次为5.10～15.85、9.61～24.88、14.96～40.73、14.87～28.54、13.83～51.98μV)均存在统计学差异。OPs O1波在P14时即已存在,而有一只小鼠(1/10)OPs第二波群在第2wk时波形不明显。

结论:本实验结果在一定程度上证实了小鼠ERG中各波形的起源。由于小鼠ERG在发育过程中的变化,在测量小鼠ERG时应当考虑到小鼠发育阶段对结果的影响。