恰玛古皂苷的提取及清除自由基活性的研究

杨保求 唐琪 蒲云峰*

（塔里木大学生命科学学院，新疆阿拉尔市843300）

恰玛古皂苷的提取及清除自由基活性的研究

杨保求 唐琪 蒲云峰*

（塔里木大学生命科学学院，新疆阿拉尔市843300）

本文分别以水、甲醇和乙醇为溶剂从新疆恰玛古中浸提皂苷，并对其清除DPPH、·OH、·O2-自由基的活性进行了研究。试验结果表明：在试验浓度范围内，恰玛古皂苷浓度与清除自由基能力呈量效关系，但均低于Vc清除自由基的能力，差异显著（≤0.01）。

恰玛古；皂苷；清除自由基

恰玛古为新疆维吾尔族对芜菁甘蓝的一种俗称，学名Brassica campestris L．(Brassica campestris L.)，是十字花科芸薹属芸薹种的芜菁亚种，主要分布在天山西南、塔里木西北，有较长的栽培历史，是维吾尔族人非常喜食的一种蔬菜[1]。近年来，一些研究报道恰玛古含有挥发油、糖苷类、皂苷、鞣质、酚类、有机酸、生物碱、黄酮、槲皮素等多种成分[2,3]，恰玛古汁或水提液具有抗突变、抗氧化作用、降低染色体畸变率、抑制肝癌细胞生长、修复辐射损伤等功效。

皂苷是自然界中具有生物活性的成分之一，据统计，有一半以上天然植物中含有皂苷[4]。近年来，关于皂苷的研究报道很多，发现了许多具有重要生物活性功能的皂苷组分。虽然，有学者对其活性进行了研究，发现具有一定的抗氧化、抗衰老、抗辐射等功能[7-9]，但是关于恰玛古皂苷生物活性方面的研究，还未见报道。此外，皂苷提取多以乙醇或甲醇为溶剂[5,6]，然后真空浓缩，再用水溶解，最后正丁醇萃取，这说明应该可以以水为溶剂提取皂苷。

目前，抗氧化能力的测定方法有很多，也没有公认的标准方法[10]。有学者对10种抗氧化方法进行了文献分析，从SCI文章中出现频率最高的方法依次为：DPPH、·OH、、ABTS、FRAP、ORAC、总酚估计法、TBARS法、硫酸氰铁法、鳌合金属离子[8]。

本研究以水、甲醇、乙醇为溶剂，提取恰玛古皂苷，以期了解三种溶剂对皂苷提取的影响，同时选择DPPH、三种方法研究其清除自由基的能力，为进一步研究开发利用恰玛古提供了理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

恰玛古，2013年11月购于阿克苏农贸市场。

甲醇、乙腈为色谱纯试剂。

齐墩果酸、乙醚、甲醇、硫酸、香草醛、正丁醇、DPPH、邻苯三酚、盐酸、三羟甲基氨基甲烷、水杨酸、硫酸铁、磷酸二氢钾、抗坏血酸等均为分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

GZX-9240鼓风干燥烘箱，上海博讯实业有限公司；

DZKW-D-2电热恒温水浴锅，北京永光明医疗仪器厂；

RE-52旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；

SHZ-D（III）循环水式真空泵，巩义予华仪器有限责任公司；

TU-1900紫外可见光分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 试验方法

1.3.1 恰玛古皂苷的提取

新鲜恰玛古切成1～2mm薄片，在70℃的条件下鼓风干燥，然后研磨成粉，过80目筛，冷藏备用；取一定量恰玛古粉，置于圆底烧瓶中，按1∶5（g/mL）的比例加入乙醚，浸泡过夜，减压过滤，然后干燥去除残留乙醚，获得脱脂恰玛古粉。称取一定量脱脂恰玛古粉，按1∶10（g/mL）的比例加入溶剂，浸泡过夜后，在温度为55℃、超声功率120W的条件下，超声25min，减压过滤，真空浓缩，蒸馏水稀释，然后用等体积水饱和正丁醇萃取两次，将两次萃取液混合并浓缩、烘干，得到样品，低温贮藏备用。

1.3.2 皂苷含量测定方法

称取一定量1.3.1的样品，甲醇溶解定容，再准确吸取皂苷溶液0.50mL于25mL试管中，加入8%香草醛乙醇溶液0.5mL和77%硫酸5mL，在70℃恒温水浴15min，然后冷水浴10min，以空白试剂为参比，在波长545nm下测定其吸光度及皂苷浓度。

1.3.3 恰玛古皂苷对DPPH自由基的清除作用

在试管中加4mL 1mmol/mL DPPH和1mL样品溶液，混匀后在暗室静置30min，然后在517nm下测定吸光度A517，每个处理均做3次平行试验。对DPPH自由基清除率见式（1）。

1.3.4 恰玛古皂苷对·OH的清除作用

在试管中加入2.0mL 6.0mmol/L水杨酸-乙醇溶液和2.0mL 2.0mmol/L FeSO4溶液，然后加入1.0mL样品溶液，再加入2mL 1.0mmol/LH2O2启动反应，37℃水浴下保温30min，在510nm测吸光值A510，每个处理均做3次平行试验。对·OH的清除率计算方法同式（1）。

取4.5mL pH 8.2 Tris-HCL缓冲液和1mL样液加入25mL试管中，在25℃下水浴保温20min，然后加入0.3mL 25℃预热过的5mmol/L的邻苯三酚，摇匀，立即在325nm波长下测定吸光度值A325，每隔30s读一次数，测定4min内的吸光值变化，每个处理均做3次平行试验，计算吸光度A325变化的速率。对·O2-的清除率计算方法见式（2）。

2 试验结果与分析

2.1 标准曲线的制备

移取0.19、0.15、0.11、0.07、0.04、0.02及0.01mg/mL的齐墩果酸甲醇溶液0.50mL于25mL玻璃试管中，各加入8%香草醛乙醇溶液0.5mL和77%硫酸5mL，在70℃恒温水浴15min，以空白试剂为参比，在波长545nm下用紫外可见分光光度计进行测定，在所测试浓度范围（0.01～0.19mg/mL）内有良好的线性关系，回归方程：

图1 皂苷的标准曲线Fig.1 The standard curve of saponins

2.2 不同溶剂提取恰玛古皂苷的含量

以水、甲醇、乙醇为溶剂，分别准确称取5.000g恰玛古粉9份，按照1.3.1的方法提取恰玛古皂苷，参照1.3.2的方法测定含量，结果见图2。

图2 不同溶剂提取恰玛古皂苷的含量（n=3）Fig.2 The saponins contents extracted by different solvents（n=3）

对不同溶剂提取获得的结果进行方差分析，甲醇和乙醇提取的恰玛古皂苷含量之间不存在显著差异（≥0.05），而甲醇和乙醇提取的皂苷含量均显著高于水提取的皂苷含量（≤0.01）。这一结果说明水确实可以作为溶剂提取皂苷，同时也可以解释大多数学者都以甲醇和乙醇为溶剂提取皂苷的原因。

2.3 清除DPPH自由基的效果

由图3可以看出，以Vc对DPPH自由基的清除率为对照，其高于恰玛古皂苷，且差异显著（≤0.01）。在试验浓度范围内，不同溶剂提取的恰玛古皂苷浓度与DPPH的清除率的呈线性相关，其清除DPPH自由基的IC50乙=2.72mg/mL＜IC50甲=2.76mg/mL＜IC50水=3.41mg/mL。这说明恰玛古皂苷具有清除DPPH自由基的能力，甲醇和乙醇提取的皂苷比水提取皂苷的DPPH清除自由基能力强，差异显著（≤0.05）。

图3 恰玛古皂苷对DPPH的清除效果的影响Fig.3 Scavenging effect of Qiamagu saponins on DPPH radical

2.4 清除·OH自由基的效果

图4 恰玛古皂苷对·OH的清除效果的影响Fig.4 Scavenging effect of Qiamagu saponins on ·OH radical

由图4可以看出，不同浓度VC显著高于恰玛古皂苷对·OH的清除能力（≤0.01）。在试验浓度范围内，不同溶剂提取的恰玛古皂苷浓度与·OH的清除率的呈线性相关，其清除·OH自由基的IC50乙=2.53mg/mL＜IC50甲=2.54mg/mL＜IC50水=3.13mg/mL。这说明恰玛古皂苷具有清除·OH自由基的能力，甲醇和乙醇提取的皂苷比水提取皂苷的清除·OH自由基能力强（≤0.05）。

2.5 清除自由基的效果

图5 恰玛古皂苷对·O2-的清除效果的影响Fig.5 Scavenging effect of Qiamagu saponins on·O2-radical

3 结论

通过试验，发现水、乙醇和甲醇均能提取恰玛古皂苷，但是甲醇和乙醇提取的恰玛古皂苷含量显著高于水提取的皂苷含量（≤0.01）。这说明乙醇和甲醇提取恰玛古皂苷的效果比水要好，这可能也是大多数研究选择甲醇和乙醇提取皂苷的原因。

在清除自由基的试验中，对照Vc高于恰玛古皂苷的清除能力（≤0.01）；在高浓度时，恰玛古皂苷对DPPH的清除率与Vc相当；在试验浓度范围内，不同溶剂提取的恰玛古皂苷浓度与的清除率的均呈线性相关，其IC50在2.53～3.82mg/mL之间，说明恰玛古皂苷具有抗氧能力。此外，甲醇、乙醇和水提取的皂苷清除自由基能力之间的存在差异，可能因溶剂极性不同，提取到的皂苷组分存在差异，而这些存在差异的皂苷组分可能具有较强的抗氧化能力。在今后的研究工作中，应对恰玛古皂苷组分及功能进一步研究。

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[3]海力茜·陶尔大洪,马桂芝,王菁,等.HPLC测定维药恰玛古儿药材中槲皮素的含量 [J].中国现代应用药学,2013,30(2)∶169-171.

[4]S.G.Sparg,M.E.Light,J.van Staden.Biological activities and distribution of plant saponins [J].Journal of Ethnopharmacology, 2004,94(2-3)∶219-243.

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Study on Free Radical Scavenging Activity of Saponins from Brassica campestris

YANG Bao-qiu TANG QiPU Yun-feng*
(College of Life Sicence,Tarim University,Alar 843300,China)

Saponins from Brassica campestris L.were extracted with water,methanol and ethanol,respectively，and their free radical scavenging activity was also studied in this paper.The experiment's results showed that saponins could be extracted form Brassica campestris L.using different solvent.However,the extracting yield of ethanol and methanol were higher than water(≤0.01).In the present study,there were dose-effect relationships between free radical scavenging activity and the concentration of saponins of Brassica campestris L.,and its scavenging activity was weaker than that of Vc(P≤0.01).

Brassica campestris L;saponins;antioxidant activity

R29

A

1008-1038(2015)10-0018-04

2015-08-13

新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室开放课题（BRYB1101）；塔里木大学校长基金硕士项目（TDZKSS201311）

杨保求（1979—），男，副教授，研究方向为食品科学与天然产物

*通讯作者：蒲云峰（1981—），男，副教授，研究方向为食品科学与天然产物