布鲁氏菌5种蛋白的原核表达及其作为间接ELISA检测用抗原的适用性比较

王 勇，南文龙，巩明霞，张悦勇，3，彭大新，陈义平

（1. 中国动物卫生与流行病学中心，诊断试剂研究室，山东青岛 266032；2. 扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009；3. 青岛农业大学，动物科技学院，山东青岛 266109）

布鲁氏菌5种蛋白的原核表达及其作为间接ELISA检测用抗原的适用性比较

王 勇1，2，南文龙1，巩明霞1，张悦勇1，3，彭大新2，陈义平1

（1. 中国动物卫生与流行病学中心，诊断试剂研究室，山东青岛 266032；2. 扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009；3. 青岛农业大学，动物科技学院，山东青岛 266109）

为比较布鲁氏菌蛋白BP26、OMP16、CP39、SP41、eryC作为间接ELISA检测用抗原的适用性，本研究原核表达并纯化了这5种蛋白，分别以其作为包被抗原，对反应条件进行优化，建立了布鲁氏菌病5种血清抗体间接ELISA检测方法。结果显示，重组蛋白BP26、OMP16、CP39、SP41、eryC大小分别约为32 ku、21 ku、30 ku、51 ku和38 ku，均可被布鲁氏菌阳性血清所识别，具有良好的免疫反应性。利用5种重组蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法，与牛结核、牛病毒性腹泻等常见牛病阳性血清之间无交叉反应；对28份阴、阳性参考血清进行检测，以BP26作为包被抗原建立的间接ELISA P/N值最高。利用建立的方法和IDEXX试剂盒对48份临床血清样品进行平行检测，重组蛋白BP26、OMP16、CP39、SP41、eryC相应ELISA方法的符合率分别为87.5 %、87.5 %、89.6 %、85.4 %、79.2 %。结合敏感性、特异性等因素综合分析，以重组蛋白BP26作为检测抗原建立的间接ELISA方法效果较为理想，可适用于临床布鲁氏菌感染的检测。

布鲁氏菌；重组蛋白；间接ELISA；适用性

布鲁氏菌病（布病）是由布鲁氏菌（Brucella）引起的以流产和发热为主要特征的人畜共患传染病[1]。近年来，我国人间和畜间布病感染率均呈现明显回升态势。

快速准确检测是防治布病的关键。目前，布病血清抗体检测方法主要有虎红平板凝集试验、补体结合试验、荧光偏振试验、ELISA等[2]。其中，ELISA技术以其敏感性高且可实现高通量检测的特点，在布病血清学检测中具有推广应用的优势。国内外学者先后应用不同的重组蛋白（如BP26、OMP16、SP41、Virb8等）作为包被抗原，建立了检测布病血清抗体的间接ELISA方法（iELISA），但检测效果不尽相同[3-7]。本研究通过原核表达纯化BP26、OMP16、CP39、SP41、eryC 这5种布鲁氏菌重组蛋白，并分别以其作为包被抗原建立iELISA方法，比较5种方法对布病血清抗体检测的适用性。

1 材料和方法

1.1 菌株及血清

牛种布鲁氏菌疫苗株A19（B. abortusA19）；牛结核阳性血清、牛大肠杆菌阳性血清、牛病毒性腹泻阳性血清、牛口蹄疫阳性血清；经虎红平板凝集试验、试管凝集试验、IDEXX ELISA试剂盒3种方法检测均为布病血清抗体阳性的参考牛血清样品20份，检测均为阴性的参考牛血清样品8份；近年来采集于我国部分布病疫区的临床牛血清样品48份。以上实验材料均由本实验室保存。

1.2 主要试剂

Taq DNA聚合酶、内切酶、连接酶、pMD18-T克隆载体购自大连宝生物公司；pET-28a（+）表达载体购自Life公司；核酸及质粒提取试剂盒购自VWI公司；His-镍柱亲和纯化试剂盒购自Clontech公司；酶标板购自云鹏科技发展有限公司；山羊抗牛IgG-HRP购自KPL公司；TMB购自Biosynth公司；牛布鲁氏菌病Pourquier® ELISA检测试剂盒购自IDEXX公司。

1.3 重组蛋白的制备及鉴定

1.3.1 引物设计与合成。根据GenBank中登录的布鲁氏菌基因组（序列号：NC-010742.1、NC-010740.1、CP009099.1）序列，利用Primer premier 5.0软件对OMP16、BP26、CP39、SP41和eryC基因设计引物，并在上下游引物两侧添加合适的酶切位点，引物由大连宝生物公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3.2 目的片段的扩增及重组表达质粒的构建。按照核酸提取试剂盒说明书提取B.abortusA19 基因组DNA，以其为模板，应用表1中的引物进行PCR 扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。将纯化的PCR 产物克隆于pMD18-T载体上，再经酶切后连接pET-28a（+）表达载体，构建重组表达质粒 pET-28a-OMP16、pET-28a-BP26、pET-28a-CP39、pET-28a-SP41、pET-28a-eryC。提取重组表达质粒，双酶切鉴定正确后，由大连宝生物公司测序。

1.3.3 重组蛋白表达与纯化。将pET-28a-OMP16、pET-28a-BP26、pET-28a-CP39、pET-28a-SP41、pET-28a-eryC转化大肠杆菌BL21（DE3），培养至对数生长期，以终浓度为1 mg/mL的IPTG 37℃诱导表达5 h，12 %SDS-PAGE凝胶电泳分析表达产物。常规方法回收包涵体蛋白，并以His-镍柱亲和纯化试剂盒纯化重组蛋白，测定蛋白浓度，Western-blot分析重组蛋白的免疫反应性。

1.4 5种蛋白进行间接ELISA的适用性比较

1.4.1 iELISA方法的建立。以纯化的重组蛋白作为包被抗原，用0.05M pH 9.6的碳酸盐包被缓冲液进行倍比稀释（浓度范围8000 ng/mL～250 ng/mL），每孔加入100 µL，4℃包被过夜。同时，将阴性和阳性血清样品分别进行50倍、100倍、200倍和400倍稀释，山羊抗牛IgG-HRP酶标二抗按1:5000稀释，进行方阵测定，确定抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度。然后，再对各反应时间以及酶标二抗工作浓度等条件分别进行优化。通过检测已知背景的牛布病阴阳血清样品，确定iELISA方法的结果判定标准。

1.4.2 交叉反应检测。分别利用5种重组蛋白建立的的iELISA方法，检测牛结核阳性血清、牛大肠杆菌阳性血清、牛病毒性腹泻阳性血清和牛口蹄疫阳性血清。

1.4.3 参考血清样品的检测。分别用5种重组蛋白的iELISA方法检测28份参考血清样品，计算每种抗原检测20份阳性血清样品OD450的平均值P和检测8份阴性血清样品OD450的平均值N，再计算P/N值。

1.4.4 临床血清样品检测。分别用5种重组蛋白的iELISA方法检测48份牛血清样品，并用IDEXX公司的牛布鲁氏菌病Pourquier® ELISA试剂盒平行检测，分析比较检测结果。

2 结果

2.1 目的基因克隆和重组表达质粒的鉴定

以B.abortusA19 基因组DNA为模板，经PCR扩增结果显示，BP26、OMP16、CP39、SP41、eryC分别扩增出约为868 bp、556 bp、732 bp、1392 bp、985 bp的目的片段，与预期大小相符（图1）。

图1 目的基因PCR扩增结果

2.2 重组蛋白的表达及Western-blot 鉴定

含重组表达质粒pET-28a-BP26、pET-28a-OMP16、pET-28a-CP39、pET-28a-SP41、pET-28aeryC的BL21菌株经IPTG诱导后，分别表达了分子量大小约为32 ku、21 ku、30 ku、51 ku和38 ku的目的条带，其大小与预期一致（图2）。经His-镍柱亲和纯化后获得纯化的重组蛋白，将纯化的重组蛋白与牛布鲁氏菌阳性血清反应，结果显示5种重组蛋白均可以被阳性血清所识别，具有良好的免疫反应性（图2）。

图2 重组蛋白的表达及western-blot鉴定结果

2.3 间接ELISA 反应程序的确定

经优化，重组蛋白BP26、OMP16、CP39、SP41和eryC的最佳包被浓度分别为0.5 µg/mL、4µg/mL、3 µg/mL、4 µg/mL 和 2 µg /mL，待检血清最佳稀释倍数为1:100。具体ELISA反应程序为：以pH 9.6的碳酸盐缓冲液将这5种重组蛋白分别稀释至各自最佳包被浓度，每孔包被100µL，4 ℃包被过夜；PBST洗涤3 次，每孔加2 % BSA封闭液300µL，37℃封闭2 h；PBST洗涤3 次，每孔加1:100稀释的待检牛血清样品及阴、阳性对照血清 100µL，37℃孵育30 min；PBST洗涤3 次，每孔加1:40000稀释的酶标抗体（山羊抗牛IgG）100µL，37℃孵育 30 min；PBST洗涤 3 次，每孔加新配制的TMB显色液100 µL，37 ℃孵育10 min ；最后，每孔加入 2 mol/L H2SO450 µL 终止反应。计算阳性对照血清OD450平均值ODP、阴性对照血清OD450平均值ODN，检测样品OD450值为ODs。 判定标准：（ODs—ODN）/（ODP—ODN）≥0.6时， 判 为 阳 性；（ODs—ODN）/（ODP—ODN）＜ 0.6时，判为阴性。

2.4 交叉反应性检测

利用5种重组蛋白建立的iELISA方法对牛结核阳性血清、牛大肠杆菌阳性血清、牛病毒性腹泻阳性血清和牛口蹄疫阳性血清进行检测，5种布鲁氏菌重组抗原与上述几种常见牛病阳性血清之间均无交叉反应。

2.5 参考血清样品检测

分别用5种重组蛋白的iELISA方法检测28份参考血清，结果显示，20份阳性参考血清检测的阳性平均值，BP26（0.415）、SP41（0.419）〉 CP39（0.36）、eryC（0.377）〉 OMP16（0.225）；8份阴性参考血清检测的阴性平均值，BP26（0.115）、OMP16（0.123）＜ CP39（0.173）＜ SP41（0.205）、eryC（0.206）；P/N值，BP26（3.6）〉 CP39（2.08）、SP41（2.04）〉 OMP16（1.83）、eryC（1.83）。结果表明，以BP26重组蛋白建立的iELISA方法，检测结果背景值最低且P/N值最高。

2.6 临床血清样品检测

分别用5种重组蛋白的iELISA方法检测48份牛血清样品，并与IDEXX ELISA试剂盒平行检测比较，结果显示，其敏感性BP26（90.9 %）、OMP16（90.9%）、CP39（97 %）、SP41（90.1 %）和eryC（90.1 %）；特异性BP26（80 %）、OMP16（80 %）、CP39（73.3 %）、SP41（73.3 %）和eryC（53.3 %）；符合率BP26（87.5%）、OMP16（87.5 %）、CP39（89.6 %）、SP41（85.4 %）和eryC（79.2 %）。结果表明，针对本次检测的48份牛血清样品，这5种重组蛋白iELISA的敏感性均大于90 %，但特异性方面差别较大，BP26、OMP16的特异性优于CP39、SP41，eryC的特异性低，仅为53.3 %。综合分析敏感性、特异性、符合率结果，以BP26检测效果较为理想。

3 讨论

常用的布病血清学检测方法中，虎红平板凝集试验操作简单、反应时间短，但易出现假阳性；试管凝集试验和补体结合试验操作相对复杂。与之相比，ELISA方法敏感、特异、易于标准化，并可实现高通量检测，具有良好的应用前景。目前，ELISA试剂盒大都是以脂多糖（LPS）作为包被抗原，LPS特异性抗体是布病血清检测方法的主要检测对象。但小肠结肠炎耶尔森菌O:9等革兰氏阴性菌与布鲁氏菌在LPS O链（OPS）上存在相同的抗原表位，检测时可能会发生交叉反应而出现假阳性结果；此外，LPS的制备涉及到布鲁氏菌培养，存在生物安全风险，高纯度LPS的制备工艺也较为复杂。应用布鲁氏菌重组蛋白作为包被抗原进行间接ELISA，则可有效避免上述问题。但应用不同布鲁氏菌重组蛋白作为包被抗原进行ELISA检测时，其检测效果是有差异的，评价检测效果时所采用的复核方法及样品也不相同，获得的评价指标间难以有效地平行比较[3-7]。

本研究原核表达了BP26、OMP16、CP39、SP41、eryC 这5种布病检测用重组蛋白，westernblot结果显示这5种重组蛋白均可以被布病阳性血清所识别，具有良好的免疫反应性。之后，比较了这5种重组蛋白作为iELISA检测抗原的适用性。这5种重组蛋白作为包被抗原的iELISA方法检测时，与牛结核、牛病毒性腹泻等常见牛病阳性血清均无交叉反应；对布病参考血清样品检测时，以BP26检测效果较好，一方面其包被浓度最低，另一方面P/N值显著高于其他4种重组蛋白，检测结果背景值更低且阴、阳性结果的区分更好。结合临床样品检测结果，综合分析敏感性、特异性、符合率等因素，以BP26作为检测抗原建立的间接ELISA方法效果较为理想，可适用于临床布鲁氏菌感染的检测。

利用5种重组蛋白进行iELISA平行检测28份参考血清样品时，发现同一血清样品针对这几种蛋白的反应性并不完全一致，如一份阳性血清针对某种蛋白所测定的OD450值是同组血清样品的最高值，而针对另一种蛋白所测定的OD450值则低于该组样品的阳性平均值。表明在布病感染的不同时期或不同感染个体中，血清中针对不同布鲁氏菌抗原的抗体含量存在差异。因此，在进行临床血清样品检测时，可选择反应谱更加宽泛的布鲁氏菌抗原，或是筛选两种及以上的重组蛋白混合包被，以获得理想的检测效果。

Prokaryotic Expression and Applicability Comparison of Five Brucella Proteins as Antigens in Indirect ELISAs

Wang Yong1，2，Nan Wenlong1，Gong Mingxia1，Zhang Yueyong1，3，Peng Daxin2，Chen Yiping1
（1. Laboratory of Diagnostics Development，China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032；2. Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009；3. Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109）

In order to compare the applicability of different coating antigens in indirect-ELISA（iELISA）for detectingBrucellaantibodies，BP26，OMP16，CP39，SP41and eryC ofBrucellawere expressed with prokaryotic system，purified and used as coating antigens respectively in iELISA assays and their effects were compared. The results showed the expressed recombinant BP26，OMP16，CP39，SP41and eryC were about 38 ku，21ku，30ku，51ku and 38ku respectively，and all of them were recognized byBrucellapositive serum. All thefive iELISA assays had no cross-reactivity with bovine tuberculosis or bovine viral diarrhea sera. Detection of 28 reference serum samples showed that the iELISA with BP26 as coating antigen had the highest P/N value. A parallel detection of 48 clinical serum samples was carried out，and compared to the results of commercial kits（IDEXX），the agreements were 87.5 % for BP26-iELISA，87.5 % for OMP16-iELISA，89.6 % for CP39-iELISA，85.4 % for SP41-iELISA and 79.2 % for eryC-iELISA. In conclusion，the effect of BP26 used as antigen in iELISA was relatively ideal.

Brucella；recombinant proteins；indirect ELISA；applicability

S852.61+4

A

1005-944X（2015）10-0072-05

青岛市科技成果转化引导计划（14-2-4-79-jch）

注：王 勇、南文龙为并列第一作者

陈义平

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胡藕祥）