脱脂沙棘籽制备活性多肽的研究

陈 彤，王常青，方 甜，白云云，宁庆鹏

山西大学生命科学学院，太原 030006

沙棘又名醋柳，是一种药食同源植物，沙棘果中含有丰富的营养物质和生物活性物质，在我国“三北”地区分布广泛。脱脂沙棘籽是沙棘榨油后的副产物，其蛋白质含量丰富［1］。经测定，脱脂沙棘籽中含有25%～30%的蛋白质，如果能够将这些蛋白质充分利用，酶解加工成小分子活性多肽，不仅可以提高蛋白的消化吸收率，还可能具有一定的保健作用［2］。长期过量饮酒或一次性大量饮酒会导致乙醇脱氢酶(ADH)活性降低，使人体对乙醇的代谢功能下降，进而加重乙醇对脑、肝脏等器官的危害作用［3］。有研究表明，具有ADH 激活作用的物质可以促进肝脏对乙醇的分解和代谢，从而起到醒酒作用。例如大豆肽、玉米肽等多肽产品可激活体外及小鼠肝脏乙醇脱氧酶的活性，加速乙醇的代谢，以达到醒酒的目的，且多肽相比传统解酒药属天然产品，具有吸收迅速发挥效果快的优点［4，5］。

目前，国内外对于沙棘黄酮及多糖的护肝作用研究较多［6］，但对沙棘籽蛋白及多肽的研究很少，尚未见到用酶解沙棘籽制备醒酒活性肽的研究。本实验采用木瓜蛋白酶水解沙棘籽制备活性多肽，该方法工艺简单，且得到的多肽对ADH 具有较高的激活率，是一种潜在的醒酒多肽，为开发新型醒酒产品提供了新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脱脂沙棘籽为二氧化碳超临界提油后的残渣，粗蛋白含量26.25%，山西五台山沙棘制品有限公司提供。菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶，广西庞博生物工程有限公司;ADH(300 U/mg)、氧化性辅酶I，上海源聚生物科技有限公司;其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Sephadex 凝胶色谱系统、UVD-680-3 紫外检测仪，上海金达生物科技有限公司;UV-2600 型紫外-可见分光光度计，尤尼科(上海)仪器有限公司;旋转蒸发仪，上海申升科技有限公司;卷式超滤-纳滤膜组件，北京安德膜分离技术工程有限公司;其它仪器为常规。

1.3 实验方法

1.3.1 沙棘籽渣酶解物的制备

脱脂沙棘籽经粉碎、过筛和去杂后，按料液比1∶ 15(m/V)加水浸泡过夜，离心取上清液，得到沙棘籽蛋白粗提液。在粗提液中分别加入菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶和无花果蛋白酶，以相同的酶活比在各蛋白酶适宜条件下酶解3 h，灭酶离心后取上清液，浓缩至多肽浓度为1.5%后备用。通过测定不同蛋白酶酶解液对ADH 的激活率，比较并筛选出对ADH 激活率最高的多肽及相应蛋白酶［7］。

1.3.2 蛋白酶酶解液及多肽对ADH 活性的研究方法

将不同样液微滤后，采用瓦勒-霍赫法测定沙棘籽酶解液对ADH 活性的激活率［8］。

ADH 活力(E)计算公式为:

式中:E——酶的活力(U);E340——340 nm 处每分钟吸光值的增大值;Ew——每毫升所用酶液中含酶量(mg/mL);6.2——NADH 的克分子吸光值系数;3.2——反应液的总体积(mL);U——在规定条件下每分钟还原l μmol NAD+时所需酶量。

式中:A——酶活力激活率(%);E样品——样品反应液的酶活力(U);E空白——空白反应液的酶活力(U)。

1.3.3 沙棘籽酶解多肽的工艺条件优化

以ADH 激活率和多肽得率为指标，分别进行酶解pH 值(5、6、7、8、9)，酶解温度(30、40、50、60、70℃)，酶解时间(1、2、3、4、5 h)和加酶量(2 000、3 000、4 000、5 000、6 000 U/g)单因素实验。由于本实验旨在制备高ADH 激活率的沙棘籽多肽，因此在单因素实验基础上，确定酶解温度、酶解时间和酶解pH 值的L9(33)正交实验方案(见表1)，并对正交实验结果进行验证，确定该醒酒肽的最佳制备工艺。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3.4 膜分离法对沙棘籽酶解液进行分级分离

选用截留分子质量为8 000、3 000、2 000、500 Da 的超滤膜和纳滤膜，分离得到5 种组分［9］，即分子质量Mw ＞8 kD、Mw 在8～3 kD、Mw 在3～2 kD、Mw 在2～0.5 kD、Mw ＜0.5 kD。将5 种分离液及原酶解液分别旋转蒸发、浓缩到相同多肽含量后备用。

1.3.5 多肽分子量及各组分含量分析

水解物中总氮量测定参照GB5009.5-2010《食品中蛋白质的测定》的方法进行;多肽含量采用GB/T 22729-2008《海洋鱼低聚肽粉》中的三氯乙酸沉淀法测定;氨基酸态氮含量测定采用甲醛滴定法。

分子量的测定采用Sephadex G-25 凝胶色谱分析法，测检波长为220 nm。Marker 为肌红蛋白(17 000Da)、胸腺肽(3 108 Da)、杆菌酶(1 486 Da)和还原性谷胱甘肽(307 Da)。以Marker 的相对分子质量对数(logMr)为横坐标，洗脱体积(Ve)为纵坐标制作曲线方程:Ve=－35.462 logMr+212.19。用峰面积归一法计算出不同多肽溶液中各段分子量的分布。

1.4 统计分析

2 结果与分析

2.1 制备沙棘籽渣醒酒肽的蛋白酶筛选结果

前期筛选实验表明，巯基蛋白酶对沙棘籽水溶性蛋白的水解物具有一定的ADH 激活率。其中，木瓜蛋白酶酶解液的ADH 激活率(30.46%)最高，菠萝蛋白酶酶解液次之，无花果蛋白酶酶解液的ADH激活率最低。因此选用木瓜蛋白酶做为醒酒活性肽的最佳用酶，进行下一步活性多肽最佳提取工艺的实验。

表2 不同巯基蛋白酶酶解沙棘籽渣蛋白粗提液效果的对比Table 2 Comparison of enzymolysis results of H.rhamnoides seed protein by different thiol proteases

2.2 木瓜蛋白酶制备沙棘籽多肽的单因素实验结果

2.2.1 酶解温度对沙棘籽多肽得率和ADH 激活率的影响

在加酶量4 000 U/g，酶解时间3 h，酶解pH 7.0 的条件下，随着温度的升高，多肽得率不断增大，60 ℃时达到最大，超过60 ℃时，多肽得率逐渐下降。温度过低会抑制酶的生物活性，但温度过高超过酶的最适温度，可能会造成酶蛋白变性，导致活性下降、得率降低。当酶解温度为50 ℃时，尽管多肽得率没有60 ℃时高，但沙棘籽多肽的ADH 激活率最高，因此选择酶解温度为50 ℃。

图1 酶解温度对多肽得率和ADH 激活率的影响Fig.1 Effect of enzymolysis temperature on the peptide yield and ADH activation rate

2.2.2 酶解时间对沙棘籽多肽得率和ADH 激活率的影响

在以上酶解条件下，ADH 活性和多肽得率开始是随着酶解时间的加长，不断增大，4 h 时达到最大;但超过4 h 时，多肽得率开始下降，超过3 h 时，ADH 激活率会逐渐下降(见图2)。这可能是随着时间的增长，酶与底物充分反应，多肽得率增大。但酶解时间过长，这可能会使前期酶解所得活性多肽被继续酶解，部分具有ADH 激活作用的活性基团遭到破坏。过长的酶解也会使部分多肽变为游离氨基酸［10］。综合考虑两方面因素，选择该酶的适宜酶解时间为3 h。

图2 酶解时间对多肽得率和ADH 激活率的影响Fig.2 Effect of enzymolysis time on the peptide yield and ADH activation rate

2.2.3 酶解pH 对沙棘籽多肽得率和ADH 激活率的影响

实验表明，随着酶解pH 的升高，多肽得率不断增大，酶解pH 为6～7 时得率最大，而ADH 激活率在pH6 时最高。当pH ＞6 或pH ＜7 时，对ADH 激活率和多肽得率均有很大的不利影响。说明pH 过低或过高均会抑制酶的活性，可能会造成酶蛋白变性。综合两方面因素，选取pH 6.0 为下一步正交实验参数。

图3 酶解pH 值对多肽得率和ADH 激活率的影响Fig.3 Effect of pH value on the peptide yield and ADH activation rate

2.2.4 加酶量对沙棘籽多肽得率和ADH 激活率的影响

加酶量与多肽得率及ADH 激活率的关系见图4。随着加酶量的不断增加，多肽得率不断增加，这是因为随着酶浓度的增加，反应速度不断增大。但当酶浓度达到4000 U/g 时，再增加过量的酶多肽得率仅略有升高，而ADH 激活率则下降。这可能是由于过度水解沙棘多肽中的活性成分，破坏了前期酶解所得活性多肽。综合前期加酶量与ADH 激活率的试验，最终选择蛋白酶添加量为4000 U/g。

图4 加酶量对多肽得率和ADH 激活率的影响Fig.4 Effect of enzyme dosage on the peptide yield and ADH activation rate

2.3 沙棘籽渣酶解多肽制备正交实验结果

根据前期单因素实验结果，以ADH 激活率和多肽得率为指标，进行沙棘籽醒酒肽制备的正交实验，结果见表3。

表3 正交实验设计与结果Table 3 Orthogonal array design and experimental results

由表3 可知，制备沙棘籽渣酶解多肽的最佳工艺组合为A3B3C2，即pH 值6.5，酶解温度50 ℃，酶解时间3.5 h。在此条件下进行验证实验，酶解多肽的ADH 激活率平均值为18.07%，高于正交表中的其他组合，证明正交实验结果可靠。各影响因素的主次顺序为A ＞B ＞C，即酶解pH 对ADH 激活率的影响最大，其次是酶解时间，酶解温度影响最小。方差分析(表4)表明，酶解pH 对酶解多肽的ADH 激活率影响显著，酶解时间、酶解温度两个因素对沙棘籽渣酶解多肽的ADH 激活率影响都不显著。正交实验的9 个条件的平均多肽得率为36.96%(统计数据略)，在A3B3C2条件下的多肽得率为38.80%，处于较高水平，说明该条件可以兼顾到多肽得率。

2.4 不同分子质量沙棘籽渣酶解多肽对ADH 激活

水解液经膜分级后测得的ADH 激活率表明，3 000 Da 以上的未显示出ADH 激活率，小于500 Da的纳滤组成其ADH 活性也很低，因为丙氨酸、亮氨酸等氨基酸具有醒酒作用［10］，而沙棘籽蛋白含有较丰富的丙氨酸、亮氨酸［11］，所以500 Da 纳滤滤出液也具有一定的ADH 激活率(5.72%)。在500-3 000 Da 的多肽中，500-2 000 Da 的多肽组分ADH 激活率最高，为57.52%，为最主要的活性多肽;其次为2 000-3 000 Da 分子量的多肽，ADH 激活率为35.09%。

表4 正交实验方差分析结果Table 4 Analysis of variance table

表5 各级分沙棘籽渣酶解多肽的对比(+sd)Table 5 Comparison of all levels of H.rhamnoides seed polypeptide(+sd)

注:与原酶解液相比，＊＊ P ＜0.01，差异极显著;* P ＜0.05，差异显著。Note:Compared with enzymolysis liquid，＊＊ P ＜0.01，extremely significant difference;* P ＜0.05，significant difference.

2.5 沙棘籽渣酶解多肽的分子量分析

凝胶色谱分析和峰面积归一法计算得知(图5、表6)，经超滤和纳滤分级后，沙棘籽酶解滤出液中，分子量在500-2 000 Da 和2 000-3 000 Da 的质量占到56.28%和10.22%，比未分级的原酶解液的高39.82%和3.89% ;而这两个级分正是ADH 激活率最高的多肽组分，这两个级分的ADH 激活率与原酶解液相比明显提高，均可做为醒酒活性多肽开发利用。

3 结论

图5 未经超滤分级(A)及3 000 Da 滤出液(B)的沙棘酶解多肽的G-25 图谱Fig.5 G-25 chromatograms of H.rhamnoides seed enzymolysis polypeptide without ultrafiltration classification(A)and 3 000 Da leaching liquid (B)

表6 沙棘酶解产物的主要成分及质量含量(%)Table 6 Contents of main constituents of H.rhamnoides seeds polypeptide (%)

本实验表明，在三种巯基蛋白酶中，木瓜蛋白酶制备的沙棘籽多肽对ADH 的激活率最高。该酶解多肽的最佳工艺条件为:酶解pH 6.5、温度50 ℃、时间3.5 h、加酶量4 000 U/g，此条件下ADH 激活率为18.07%，其中酶解pH 值对ADH 激活率的影响显著。研究表明，分子量在500-2 000 Da 的酶解多肽的ADH 激活率比未分级的原酶解液极显著提高(P＜0.01)，达到57.52%，为醒酒肽主要活性成分，其次为分子质量在2 000-3 000 Da 的多肽ADH 激活率为35.09%。超滤与纳滤分离得到的500-3 000 Da 组分质量占水解液中多肽总质量的66.50%，为下一步开发醒酒保健食品奠定了基础。

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