油橄榄叶提取物体内外抗氧化活性研究

2015-01-08何海荣王宁丽田亚涛谢雪健刘晔玮

天然产物研究与开发 2015年10期

郑洁，何海荣，王宁丽，裴栋，田亚涛，谢雪健，刘晔玮*

兰州大学公共卫生学院营养与食品卫生研究;2 中国科学院兰州化学物理研究所中科院西北特色植物资源化学重点实验室，兰州 730000

油橄榄(Olea europaeaL.)属木樨科(Europaea)木樨榄属(Olea)植物，是世界著名的常绿木本油料和果用树种［1］。流行病学［2，3］和动物实验［4］都证明了橄榄油具有降低心血管疾病、胃癌、乳腺癌等疾病发病率的潜在作用，这种作用不仅归因于橄榄油中不饱和脂肪酸和维生素等生物活性物质，还与其中具有抗氧化活性的酚类化合物有关［5］，而油橄榄叶中的抗氧化活性物质含量高于油橄榄果、茎和树皮［6］。

目前，关于油橄榄叶提取物的分离纯化［7，8］及抗癌［9，10］、降血压［11］、降血糖［12］等各种生理活性及体外抗氧化活性的研究较多，Coban［13］等研究了油橄榄叶提取物的体内抗氧化活性，但对其抗氧化活性的系统研究鲜见报道。本文通过观察小鼠体内抗氧化指标和组织形态学的变化，结合体外清除DPPH·和·OH 的能力，系统研究了油橄榄叶提取物的抗氧化作用，为充分利用目前被废弃的油橄榄叶，开发具有保健功能的油橄榄多酚产品，延长产业链，实现种植和精深加工多形式的优化组合提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 受试样品

油橄榄叶提取物(陇南田园油橄榄科技开发有限公司提供，课题组经HPLC 法测定橄榄苦苷含量为22.3%);橄榄苦苷(购自青岛耐特生物技术有限公司，课题组经HPLC 法测定其含量为98.2%)。

1.1.2 主要试剂与仪器

试剂:D-半乳糖(D-gal)、Coomassie Brilliant Blue G-250、Albumin Bovine V(Sigma，美国);维生素E(VE)(江西天之海药业股份有限公司);1，1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH·)标准品(批号S43654-098，Sigma，美国);抗坏血酸对照品(批号:A-4544，购自Fluka 公司，美国);丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒(批号:20140312，南京建成生物工程研究所);其它试剂均为分析纯，水为实验室自制双蒸水。

仪器:旋涡混合器(海门市麒麟医用仪器厂);L600 台式低速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);Microfuge®22R Centrifuge(美国贝克曼库尔特/Beckman Coulter);UV759 紫外-可见分光光度计(上海精密仪器科技有限责任公司)。

1.1.3 实验动物

25 g 左右雄性健康成年昆明种小鼠90 只，购于兰州大学医学院动物实验中心(动物合格证号:甘医动字第14-006);饲养条件:温度18～22 ℃，光暗周期12 h:12 h，群养，3 只/笼，常规喂养饲料，自由饮水。

1.2 方法

1.2.1 体外清除自由基作用

参照文献［14，15］方法及预实验结果，以抗坏血酸、橄榄苦苷为对照，测定各质量浓度的油橄榄叶提取物对DPPH·和·OH 的清除率，分别计算其半数抑制浓度(IC50)。

1.2.2 D-gal 致衰老小鼠抗氧化作用

1.2.2.1 动物分组及给药剂量设置［16］

小鼠按体重随机分为6 组，即:空白组、D-gal 模型组、油橄榄叶提取物低、中、高剂量组、VE 组。油橄榄叶提取物组给药量分别为58、116、232 mg/kg BW;VE 组VE 灌胃100 mg/kg BW;空白组与D-gal模型组灌胃等量生理盐水。除空白组外，其余各组均每日颈背部皮下注射D-gal 200 mg/kg BW，注射量为0.1 mL/10 g，空白组每日皮下注射等量生理盐水。每3 d 称体重和食物，换算灌胃量并计算食物利用率。D-gal 与油橄榄多酚均连续给药30 d。

1.2.2.2 体内抗氧化指标测定

各组于实验末日禁食16 h 后摘眼球采血，离心取血清-80 ℃保存备用，同时迅速取出小鼠脑、肝组织做成10%匀浆，离心取上清液-80 ℃保存备用。按试剂盒说明操作，测定血清、肝组织、脑组织中MDA 含量、SOD 和GSH-Px 活性;蛋白质测定采用考马斯亮蓝法。

1.2.2.3 小鼠肝脏和大脑组织形态学观察

取部分肝脏和大脑组织，制成HE 染色切，在光学显微镜下观察。

1.2.3 数据处理

实验结果采用SPSS17.0 软件进行单因素方差分析、多重比较和直线回归分析。以P＜0.05 为结果差异存在统计学意义，以P＜0.01 为更有理由相信结果差异存在统计学意义。

2 实验结果

2.1 体外清除自由基作用

各质量浓度的油橄榄叶提取物对DPPH·和·OH均有一定的清除作用，并呈剂量-效应关系(图1、2)。抗坏血酸、橄榄苦苷和油橄榄叶提取物对DPPH·和·OH 的IC50分别为0.016、0.058、0.064 mg/mL;0.052、0.046、0.066 mg/mL。

图1 油橄榄叶提取物清除DPPH·的活性Fig.1 DPPH· scavenging activities of O.europare leaf extracts

图2 油橄榄叶提取物清除·OH 的活性Fig.2 ·OH scavenging activities of O.europare leaf extracts

2.2 小鼠血清、肝脏组织、大脑组织的MDA 含量、SOD 和GSH-Px 酶活性测定结果

各组血清、肝脏组织的SOD、GSH-Px 活性和大脑组织的SOD 活性与D-gal 模型组比较都有所增加(表1～3)，差异均有统计学意义;各组血清、肝脏组织以及高剂量组大脑组织的MDA 水平的与D-gal模型组比较都有所降低(表1～3)，差异均有统计学意义。说明衰老模型建立成功。与空白组相比，各组高剂量组的GSH-Px 活性明显升高(表1、2)，SOD活性明显升高(表1～3)，MDA 含量明显降低(表1～3)，差异具有统计学意义。表明油橄榄叶提取物能显著提高体内抗氧化酶活力。

2.3 小鼠肝脏和大脑组织形态学观察

2.3.1 肝脏组织形态学观察

D-gal 模型组肝小叶失去正常结构，肝索排列紊乱，肝细胞弥漫水肿，界限不清，胞浆疏松化或呈空泡样变，细胞形态不规则，排列不整齐，可见点状坏死，肝血窦变狭窄，血管外周间隙增大(图3B)。油橄榄叶提取物低、中、高剂量组肝小叶结构、肝细胞索排列、肝细胞水肿、细胞增生程度与D-gal 模型组相比，逐步恢复，并随油橄榄叶提取物剂量的增加，恢复程度也逐渐增加(图3 C、D、E);VE 组肝小叶结构基本恢复正常，肝细胞索排列规则，细胞轻度增生(图3F)。

表1 油橄榄叶提取物对血清MDA、SOD、GSH-Px 的影响(±s，n=15)Table 1 Effect of O.europaea leaf extracts on serum MDA，SOD，GSH-Px levels (±s，n=15)

注:与D-gal 模型组比较，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与空白组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。Note:Compared with the D-gal model group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;compared with the control group，△P ＜0.05，△△P ＜0.01.

表2 油橄榄叶提取物对肝组织MDA、SOD、GSH-Px 的影响(±s，n=15)Table 2 Effect of O.europaea leaf extracts on liver tissue MDA，SOD，GSH-Px levels(±s，n=15)

表3 油橄榄叶提取物对脑组织的MDA、SOD 的影响(±s，n=15)Table 3 Effect of O.europaea leaf extracts on brain tissue MDA and SOD levels(±s，n=15)

图3 空白组(A)、D-gal 模型组(B)、低剂量组(C)、中剂量组(D)、高剂量组(E)及VE 组(F)肝脏组织HE染色照片(10 ×40)Fig.3 HE staining images of liver tissues from blank (A)，D-gal model (B)，low-dose (C)，middle-dose (D)，high-dose (E)and VE groups (10 ×40)

2.3.2 大脑组织形态学观察

2.3.2.1 小鼠大脑皮层形态学观察

D-gal 模型组神经元细胞排列稀疏紊乱，椎体细胞数量少，细胞脱失明显，甚至仅见少量残存的不规则细胞，并出现细胞核溶解，细胞轮廓不清晰，胞浆疏松，并有炎性细胞浸润(图4B)。油橄榄叶提取物低、中、高剂量组神经元细胞数量较多，细胞核多是中间位，可见少量细胞固缩，并随着油橄榄叶提取物剂量的增大，恢复程度逐渐增加(图4 C，D，E)。VE组神经元细胞基本恢复，数量较多，形态基本正常，细胞核多是中间位，可见少量细胞固缩(图4 F)。

2.3.2.2 小鼠大脑海马结构形态学观察

图4 空白组(A)、D-gal 模型组(B)、低剂量组(C)、中剂量组(D)、高剂量组(E)及VE 组(F)大脑皮层HE染色照片(10 ×40)Fig.4 HE staining images of cerebral cortex from blank(A)，D-gal model (B)，low-dose (C)，middle-dose(D)，high-dose (E)and VE groups (10 ×40)

D-gal 模型组小鼠海马锥体细胞排列稀疏紊乱，细胞脱失明显，甚至仅见少量残存的不规则细胞，较多神经元出现核固缩、溶解，细胞间隙扩大，排列松散，细胞轮廓不清晰，胞质染色呈深红色(图5B)。油橄榄叶提取物低、中、高剂量小鼠海马齿状回区细胞结构相对完整，细胞形态良好，无明显变性细胞，并随着油橄榄叶提取物剂量的增大，恢复程度逐渐增加(图5 C、D、E)。VE 组小鼠大脑海马齿状回区基本恢复，锥体细胞排列整齐、紧密，层次丰富，形态正常，无变性，核大而圆，细胞质丰富(图5F)。

图5 空白组(A)、D-gal 模型组(B)、低剂量组(C)、中剂量组(D)、高剂量组(E)及VE 组(F)海马结构HE染色照片(10 ×40)Fig.5 HE staining images of hippocampal structure from blank (A)，D-gal model (B)，low-dose (C)，middle-dose (D)，high-dose (E)and VE groups (10 ×40)

3 讨论

3.1 油橄榄叶提取物的抗氧化作用

体外实验结果表明，油橄榄叶提取物能有效地清除DPPH·和·OH。体内实验结果表明，油橄榄叶提取物能降低小鼠血清、肝脏和脑组织中的MDA含量，增加小鼠血清和肝脏组织中SOD 和GSH-Px的活性，增加小鼠脑组织中SOD 的活性，且呈剂量-效应关系，提示油橄榄叶提取物可能通过提高机体抗氧化酶的活性达到清除自由基的目的，从而增强了机体的抗氧化能力。体内、体外及病理形态学的结果都说明油橄榄叶提取物具有较好的抗氧化活性。

3.2 油橄榄叶提取物各成分间的抗氧化协同作用

油橄榄叶提取物除含有22.3%的橄榄苦苷，还有木犀草素-7-O-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷和羟基酪醇醋酸酯［17］等多种抗氧化活性成分。Benavente［18］等研究报道，油橄榄叶提取物的Trolox当量抗氧化能力(TEAC)值比理论上提取物中其他酚类活性物质相加的平均TEAC 值高出72%，表明油橄榄多酚清除自由基能力具有协同作用;Mylonaki［19］等对油橄榄叶提取物的总多酚和其抗自由基活性值之间做了简单线性回归分析，结果显示了低的相关性，无统计学差异(R2=0.273，P＞0.05)，这表明它不是纯粹的多酚类物质提供高抗氧化能力，相反，这种效力可能是通过各种酚类成分之间的相互作用。因此，提示油橄榄叶提取物的抗氧化能力可能呈协同作用，即油橄榄叶提取物中的多种抗氧化活性成分共同协作，在机体内发挥较强的抗氧化功能。根据以上研究结果，本实验中油橄榄叶提取物对衰老小鼠的抗氧化作用通过多种抗氧化成分共同作用，因而抗氧化能力较强。建议在今后对油橄榄叶的进一步加工和应用时，保留油橄榄叶提取物多种活性成分。

综上所述，油橄榄叶提取物具有较好的抗氧化功能，其机制与清除体内自由基，增加体内抗氧化酶活性有关。本实验对油橄榄叶提取物抗氧化功能的研究，为深入研究其抗氧化机制提供理论基础，为天然药物和保健食品的研究和开发提供理论和临床依据。

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