MGMT 与脑胶质瘤相关性的实验研究

张露勇 ，罗菲亚，胡培丽，单 纯，李 锐(.中国食品药品检定研究院食品化妆品所，北京 00050;2.中日友好医院神经外科，北京 00029)

脑胶质瘤是颅内最常见的原发性肿瘤，来源于神经胶质细胞，起源于神经外胚层。胶质瘤发病率高，约占颅内肿瘤的35%～61%［1］，且近年来还有不断增加的趋势［2］。胶质瘤呈弥漫性浸润性生长，与周围正常脑组织无明显界限，难以手术切除，因而术后的复发率高。以手术治疗、放射治疗、化学药物治疗等组成的综合治疗体系是目前脑胶质瘤治疗的主要方法［3］。由于其复发率高的特点，化疗对于抑制肿瘤的复发具有十分重要的作用［4］，但并非所有的患者均可获得很好的化疗效果，化疗药物的耐药是胶质瘤治疗失败的原因之一。因此，克服耐药性是提高脑胶质瘤患者生存率的关键。

DNA 修复蛋白O6-甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转移酶(O6-methylguanine DNA-methyltransferase，MGMT)基因是常见的针对烷类化疗药的耐药基因，它在脑胶质瘤组织中的增多与肿瘤耐药性有关。MGMT 蛋白是一种DNA 直接修复酶，能修复DNA 序列中的O6-甲基鸟嘌呤损伤。但是有研究证实，如果其DNA 修复能力增强，肿瘤易感性降低，则对化疗可能存在抵抗作用［5］。MGMT 蛋白的表达主要受启动子甲基化的调控，启动子甲基化可以下调其基因转录，导致细胞内MGMT 蛋白表达的下降，反之启动子去甲基化则可以增加蛋白的表达，从而使得肿瘤细胞对烷类化疗药产生耐药性［6］。由此可以提出假设，若能在化疗前检测脑胶质瘤的耐药基因，则能识别化疗有效的人群，从而提高胶质瘤的疗效。

本研究采用免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)方法检测MGMT 在胶质瘤及正常脑组织中的表达;采用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR，MSP)测定的方法检测MGMT 基因启动子甲基化与MGMT 蛋白表达的相关性，系统分析MGMT 与肿瘤恶性程度的关系，与胶质瘤患者的年龄、性别之间的关系，以期为脑胶质瘤的发生、肿瘤耐药性机制及临床诊治提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机收集中日友好医院神经外科2010 年7 月至2014 年7 月术中切除的病理诊断为脑胶质瘤的石蜡包埋组织标本共计45 例，并按照2007 年WHO 中枢神经系统肿瘤分类标准进行分级(Ⅰ～Ⅳ)，所有病例术前均未行放化疗，也无身体其他部位的肿瘤。45 例标本中，男性25 例，年龄20～71 岁，平均年龄42.48 岁;女性20 例，年龄19～72 岁，平均年龄40.21岁。正常脑组织11 例，均为因脑动静脉畸形行手术切除的正常脑组织以及肿瘤周围正常脑组织，作为对照组。

1.2 研究方法

1.2.1 免疫组织化学(IHC)检测:本研究采用S-P 免疫组织化学染色法对脑胶质瘤组及正常脑组织组进行染色，其步骤大致分为石蜡切片的制备、HE 染色及IHC 检测。其染色结果按照Krajewska 法进行半定量分析:高倍镜(×400)下随机计数5 个视野阳性细胞，阳性细胞≤4%为0 分、5%～24%为1 分、25%～49%为2 分、50%～74%为3 分、≥75%为4 分;染色强度:无色为0 分、1～4 分为弱阳性(+)、5～8 分为中等阳性(+ +)、9～12 分为强阳性(+ + +)。

1.2.2 甲基化特异性PCR(MSP)测定: 其步骤大致分为DNA 的提取、DNA 亚硫酸氢钠的修饰及甲基化特异性PCR。其结果判定标准为:MGMT 甲基化基因(MGMT methylation gene，MGMT-M)表达阳性或MGMT-M 和MGMT 去甲基化基因(MGMT demethylation gene，MGMT-D)同时表达阳性为甲基化;MGMT-D 表达阳性为去甲基化。

1.3 统计学方法

本研究所有实验数据均采用SPSS 13.0 统计学软件进行处理，采取χ2检验分析的方法，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MGMT 在脑胶质瘤和正常脑组织中的表达情况

45 例脑胶质瘤中20 例MGMT 蛋白表达为阳性，阳性表达率为44.44%(20/45)，而11 例脑动静脉畸形脑组织中只有1 例MGMT 的表达为阳性，阳性表达率为9.09%(1/11)。经统计学分析，二者之间的差异具有统计学意义(χ2=4.714，P=0.030，即P＜0.05)。

2.2 MGMT 在不同级别脑胶质瘤中的表达情况

MGMT 在不同级别的脑胶质瘤中均有表达，具体表达情况如下:Ⅰ级阳性率为57.14%(4/7)，Ⅱ级阳性率为40.00%(4/10)，Ⅲ级阳性率为43.75% (7/16)，Ⅳ级阳性率为50.00%(6/12)。经统计学分析发现，不同级别胶质瘤之间的MGMT 表 达 差 异 无 统 计 学 意 义(χ2= 0.596，P= 0.897 ＞0.05)。

2.3 脑胶质瘤组织中MGMT 的表达与性别及年龄的相关性

MGMT 在男性中表达阳性率为56.00%(14/25)，在女性中表达阳性率为45.00%(9/20)，经统计学分析男、女性别组间MGMT 表达阳性率差异无统计学意义(χ2=0.538，P=0.463，即P＞0.05);MGMT 在≥40 岁年龄组中表达阳性率为54.17%(13/24)，在＜40 岁年龄组中表达阳性率为47.62%(10/21)，经统计学分析上述不同年龄组间MGMT 表达阳性率差异无统计学意义(χ2=0.192，P=0.661 ＞0.05)。

2.4 MGMT 基因启动子甲基化与蛋白表达的相关性

MGMT 基因启动子甲基化发生率为57.78%(26/45)，其中蛋白表达阳性组中，甲基化的发生率为38.89%(7/18)，蛋白表达阴性组中，甲基化的发生率为70.37%(19/27)，2 组比较，MGMT 基因启动子甲基化发生率差异有统计学意义(χ2=4.388，P=0.036 ＜0.05)。相关性分析发现，MGMT 蛋白表达与MGMT 基因启动子甲基化存在负相关，见表1。

表1 MGMT 基因启动子甲基化与蛋白表达的相关性分析Tab 1 Correlation of MGMT gene promoter methylation with protein expression

2.5 不同级别脑胶质瘤中MGMT 基因启动子甲基化的表达

脑胶质瘤MGMT 基因启动子甲基化发生率及不同肿瘤级别甲基化阳性率见表2。经统计学分析发现，不同级别胶质瘤之间的MGMT 基因启动子甲基化的表达差异无统计学意义(χ2=5.277，P=0.153 ＞0.05)。

3 讨论

胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，来源于神经胶质细胞，具有高度侵袭性，呈弥漫性浸润生长，约占颅内肿瘤的50%～60%，国内报道占原发性颅内肿瘤的40%［7］。世界卫生组织2007 年根据肿瘤的组织学及病理学因素将肿瘤分为Ⅰ～Ⅳ级，低级别胶质瘤的治疗方法以手术切除为主，术后辅以放疗。高级别胶质瘤手术切除后容易复发，且难以大范围地切除，对射线的敏感性低，普通化疗药物也难以通过血脑屏障。即使联合治疗，其中未复发时间也仅有21 个月［8］。化疗是恶性胶质瘤常规治疗手段之一，在延长患者的生存方面有十分重要的作用。替莫唑胺是第2 代烷化剂，目前被作为胶质瘤化疗的一线用药。其作用靶点在肿瘤细胞的DNA 上，当肿瘤细胞的DNA 修复能力增强时，就会产生耐药现象，耐药性的产生限制了烷化剂的临床应用，所有胶质瘤化疗效果不佳的根本原因是肿瘤耐药［9］。MGMT 是DNA修复基因中的一部分，其在体内是否表达及表达的强度影响着疗效，而MGMT 蛋白的表达强度又与MGMT 启动子甲基化有关［10］。本研究通过检测脑胶质瘤组织中MGMT 的表达情况，为脑胶质瘤的发生和耐药机制提供依据，为肿瘤患者个体化治疗选择合理的方案提供参考。

表2 不同级别脑胶质瘤中MGMT 基因启动子甲基化的表达Tab 2 MGMT gene promoter methylation expression in different grade of gliomas

MGMT 蛋白是一种高效的DNA 直接修复酶，能修复DNA序列中的O6-甲基鸟嘌呤，正常组织中有一定水平的MGMT 表达，其存在可抑制突变的发生和原癌基因的活化，是机体抵抗烷化剂损伤的主要因素［11］。MGMT 既是抗癌基因又是耐药基因，如果其DNA 修复能力增强，肿瘤易感性降低，则对化疗可能存在抵抗作用。在本研究中，11 例正常脑组织中有1 例MGMT 表达阳性，阳性率为9.09%。45 例脑胶质瘤中有20 例MGMT 蛋白有阳性表达，阳性率为44.44%，显著高于正常脑组织(P＜0.05)。有研究表明，MGMT 在脑胶质瘤组织中的表达与肿瘤耐药性有一定联系，可能影响患者的预后，MGMT 表达阴性的患者烷化剂药物的近期疗效和生存时间明显优于MGMT 表达阳性的患者［12］。

由本研究可以看出，MGMT 在不同级别的胶质瘤中表达虽然有所不同，Ⅰ级阳性率为57.14%，Ⅱ级阳性率为40.00%，Ⅲ级阳性率为43.75%，Ⅳ级阳性率为50.00%，但经统计学分析，差异并无统计学意义(P＞0.05)，因此可以粗略得出，MGMT 的表达与肿瘤的恶性程度之间并无关系，这与Esteller 等［13］研究得出的结论相一致。但是也有学者认为，脑胶质瘤MGMT 的表达与肿瘤恶性程度呈正相关［14-15］。造成这些不同结论的原因可能与免疫组织化学的检测方法、样本量的多少等因素有关，进一步证实尚需大样本的临床研究支持。

本研究也分析了性别及年龄的因素与MGMT 表达的相关性，结果显示，MGMT 在男性中表达阳性率为56.00%，在女性中表达阳性率为45.00%，经统计学分析2 组间差异无统计学意义(P＞0.05);MGMT 在≥40 岁年龄组中表达阳性率为54.17%，在＜40 岁年龄组中表达阳性率为47.62%，经统计学分析2 组间差异无统计学意义(P＞0.05)。这与Esteller M等［16］报道的结果相一致。因此本组认为，临床上为脑胶质瘤患者制订个体化化疗方案时，性别及年龄不能作为单独的参考因素。

有研究指出，MGMT 基因启动子去甲基化会导致MGMT 蛋白表达的增加，这是烷化剂耐药的主要原因。由此可以推断出，基因启动子甲基化的检测可能成为预测肿瘤对烷化剂化疗药敏感性的标志［17］。本研究的45 例脑胶质瘤标本中，18 例MGMT 蛋白表达阳性，其中甲基化的7 例;27 例MGMT 蛋白表达阳性，其中甲基化的19 例。MGMT 蛋白表达与MGMT 基因启动子甲基化存在负相关(P＜0.05)。MGMT 基因启动子甲基化发生率为57.78%，且不同级别胶质瘤中甲基化的表达无明显差异(P＜0.05)。有研究报道［18］脑胶质瘤组织与血清中MGMT 基因启动子甲基化的情况具有一致性，因此测量血清中MGMT 基因启动子甲基化的情况，既可以避免穿刺活检的有创风险，又可以达到对肿瘤早期诊断的目的。

脑胶质瘤组织与正常脑组织中MGMT 的表达差异有统计学意义。MGMT 在不同胶质瘤中的表达不同，但差异无统计学意义，说明MGMT 的表达与肿瘤的恶性程度无相关性，但与烷化剂耐药有关。MGMT 在性别及年龄之间的表达差异无统计学意义，故临床上为患者制订个性化治疗方案时，不能单独考虑性别、年龄的因素。MGMT 基因启动子甲基化与MGMT的表达关系密切，使用烷化剂化疗前测定肿瘤细胞的MGMT活性具有一定的指导意义。

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