果树抗寒性研究进展

王菲+尹燕雷+冯立娟+杨雪梅+王长君

摘要：综述了国内外学者在果树抗寒性研究方面的新进展，包括细胞结构及其动态变化、组织器官类型、生理生化机制、分子生物学和抗寒途径等方面。同时，对今后果树抗寒性着重研究的领域提出展望。

关键词：果树；抗寒性；生理生化机制；分子生物学； 研究进展

中图分类号：S66-3文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）09-0141-05

寒害是全世界果树生产面临的一个严峻问题，它不仅会损伤树体还严重影响果实产量和品质，使农户蒙受巨大的经济损失。本文通过对果树抗寒生理生化机制、分子机制和抗寒途径等方面进行综述，以期为今后果树抗寒机理的深入研究、抗寒种质的筛选、抗寒生物技术的应用提供科学的依据。

1细胞形态与组织器官方面研究

1.1叶片细胞结构及其动态变化与抗寒性

叶片细胞结构是果树对环境长期适应的结果，它能够反映果树抗寒性强弱，但相关性因果树品种而不同。核桃叶片总厚度与栅栏组织厚度均与抗寒性强弱呈正相关[1]，澳洲坚果气孔密度大的抗寒性强[2]，番荔枝叶脉突起度大的抗寒性强[3]。此外，质壁分离现象也与抗寒性密切相关。苹果在越冬期间皮层细胞质壁分离出现得早、复原得快，即原生质体孤立程度强烈，这类品种抗寒性强[4]。

1.2组织器官类型与抗寒性

皮层与木质部是果树枝和干的组成部分，两者体积比与抗寒性紧密相关[5]，木质部越多则该树种或品种的抗寒性越强。果树各组织器官在不同时期抗寒性一般表现为木质部>叶芽>花芽[6]，在枝条组织上表现为韧皮部>木质部>形成层>髓。

2抗寒性生理生化机制研究进展

2.1膜系统的结构和成分与抗寒性

“膜脂相变”学说[7]指出低温下生物膜发生相变，结构的破坏导致植物受到不同程度的伤害。降温超过一定程度，膜因收缩产生孔道或龟裂使得透性变大、膜上结合酶活性丧失、细胞失去相应的代谢功能。与其它细胞成分相比，生物膜更易受到低温伤害。果树抗寒性与膜脂不饱和度呈正相关。低温条件下，细胞膜系统稳定性的提高，对于提高果树抗寒力、增强适应性是十分重要的。

2.2膜脂过氧化、抗氧化系统与抗寒性

“超氧化物学说”在20世纪中叶由Havman首先提出。果树受到低温胁迫时会产生过氧化作用，这是由增加的活性氧和自由基导致的。丙二醛（MDA）含量变化能够反映果树受低温伤害的程度，因为它是膜脂过氧化的产物。在杏的研究中发现MDA含量与抗寒性呈负相关[8]，并将其作为耐寒株系和品种的筛选依据。果树本身所含的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）及抗坏血酸氧化酶（ASP）等，能够消除活性氧、避免毒害，组成自身免疫的保护酶系统。苹果花芽中SOD、POD活性越高，耐寒力越强[9]。在生物体内，保护酶系统协同作用，能够保证自由基浓度不超过临界值，自由基就不会造成伤害。

2.3细胞渗透调节物质与抗寒性

2.3.1无机离子与抗寒性低温伤害促使无机离子外渗[10]，是因为膜透性增加甚至失去半透性。膜能否恢复半透性，视果树受害程度而定，而这又取决于植株的抗寒性。果树受到低温伤害时，或许外部形态[11]尚未发生任何变化，但电解质外渗现象一般会存在，这种现象出现的早晚也可作为抗寒力强弱的体现。细胞膜透性增加与电解质外渗率呈正相关，与果树抗寒性呈负相关，这在苹果[12]、葡萄[13]、猕猴桃[14]、柑橘[15]等的抗寒研究中都得到证实和应用。

2.3.2可溶性糖与抗寒性可溶性糖作为渗透调节物质，可以降低凝固点，从而保护细胞质免于过度脱水。果树受到低温胁迫时，可溶性糖含量增加，这在芒果[16]、香蕉[17]、菠萝蜜[18]等的研究中都有体现。另外，糖为脂肪和淀粉等物质的合成提供代谢底物，这些物质的累积对果树安全越冬是十分重要的。

2.3.3可溶性蛋白与抗寒性随着温度逐渐降低，细胞内蛋白质对果树抗寒力的提高起着重要作用[19]。抗寒力弱的品种可溶性蛋白质增加有限。可溶性蛋白的变化不仅体现在数量上，也体现在种类上即有新的蛋白产生。新蛋白质有的作为酶促进抗寒代谢反应发生，有的能够加固膜系统，还有的作为抗寒蛋白使细胞液在冰冻低温下维持冷冻状态。

2.3.4脯氨酸与抗寒性果树遭遇逆境时，脯氨酸便会积累，这是因为逆境激活了脯氨酸的合成过程[20]，同时抑制了脯氨酸的降解过程。逆境消除后，脯氨酸又被分解利用，这是个迅速的过程。脯氨酸不仅是一种渗透调节物质，而且还可作为活性氧的清除剂稳定蛋白质、DNA和膜[21]，降低凝固点防止细胞脱水，作为能量库调节细胞氧化还原势。果树经低温胁迫后，游离脯氨酸含量迅速提高，可作为抗寒性评价指标之一，这点在葡萄、樱桃、苹果等果树上都有体现和应用。脯氨酸的合成部位在根部，之后再运输到地上部起作用。

2.4激素与抗寒性

抗寒相关激素研究最多的为脱落酸（ABA），它是一种信号因子，会对逆境产生响应。果树在低温锻炼过程中积累的ABA对提高抗寒性效果明显[22]。在梨树上，当游离脱落酸 （F-ABA）含量增加时，结合脱落酸 （C-ABA）含量就会降低，则抗寒性提高[23]。外施ABA可以增强果树的抗寒力，同时还可促进休眠、降低冬芽和枝条含水量。

学者们在最初研究抗寒相关激素时选择的是赤霉素（GAs）。抗寒力的获得与该激素含量下降有关，因为这种现象使长势减弱。在杏树[24]等多种果树上通常抗寒性强的品种GAs含量低于抗寒性弱的。

ABA和GAs含量的比值与果树抗寒性密切相关。ABA/GA比值增高时，低温半致死温度也会相应增加。果树遭遇低温时，ABA/GA比值增高，表明抗寒力提高；低温解除后，ABA/GA比值下降，抗寒力降低，低温及ABA首先诱导ABA/GAs的积累，再由ABA/GAs启动特异性板机，最终合成抗寒特异蛋白质，进而提高柑橘的抗寒力。endprint

2.5细胞内水的形态与抗寒性

细胞内水分以两种形式存在，即自由水和束缚水，两者所占的比例可以反映果树抗寒性。低温促使自由水减少，束缚水比例增加[25]，抗寒性产生并逐步提高。冬季杏树束缚水比重增加越快，表明该品种越抗寒。在梨树上，是否抗寒以比值1为界，当比值大于1时，该品种才具抗寒性。

3分子生物学领域抗寒性研究进展

分子生物学在20世纪中期以后发展迅速，理论和方法日趋完善，抗寒机理也随之迈向分子领域，并取得了显著进展。抗冻基因的类型和功能、抗冻蛋白的分离和表达调控、以及低温信号转导调节机制等方面，成为学者们研究抗寒性的重点。抗寒基因工程已成为果树遗传育种的一条重要途径，因其具有育种周期短、物种改良空间大的优点。目前已经分离鉴定出许多抗寒相关基因，将抗寒基因转入草莓[26]、香蕉[27]、苹果[28]等，明显提高了植物抗寒性。

3.1抗寒基因与抗寒特异性蛋白种类

抗寒基因分功能基因和调控基因两种，前者保护膜免受低温伤害，包括冷诱导基因（COR）、抗氧化酶基因、脂肪酸去饱和酶基因等[29]；后者调控信号传导、基因表达和蛋白活性，主要有CBF、ICE、b-ZIP、WRKY、NAC等转录因子基因[30]。

抗寒特异性蛋白分为保护性蛋白和调节蛋白，前者种类很多，有抗冻蛋白、微管蛋白、COR蛋白、脱水蛋白、水通道蛋白、伴侣蛋白、解毒酶[31]等；后者包括转录因子、蛋白激酶和磷酸肌醇代谢酶类。有些学者依据抗寒蛋白与ABA的关系，将蛋白合成途径分为ABA依赖和非ABA依赖两种。近年来，学者们在质膜抗寒蛋白的分离、功能鉴定[32]和表达调控等方面做了大量工作。有些果树经低温锻炼会产生冷击蛋白；微管结合蛋白与激素变化和信号转导有关；磷脂酶参与信号转导[33]，对环境胁迫和植物激素作出响应，增强抗寒性。

3.2钙信使系统与果树抗寒性

胞内Ca2+信号转导机制与植物抗寒性密切相关[34]，钙信使系统可通过调节与冷相关的基因表达而参与植物对低温胁迫的反应与适应。核桃叶肉细胞中的钙调素（CaM）主要定位于细胞核和叶绿体中[35]，线粒体中也有一定量的CaM存在。CaM含量变化反映果树抗寒性强弱，抗寒品种低温胁迫初期其含量增加，后期含量降低迟于不抗寒品种。膜的密闭性是钙信号传递的基础，通过突触结合蛋白SYT1功能区[36]使耐冷性得以表达。高渗条件下质膜上钙联蛋白累积，H+-ATP酶在上游被调控从而加速离子流出。

3.3果树基因工程研究进展

近年来，果树抗寒研究逐步深入到分子水平，并取得非常大的成绩。基因序列分析技术的产生和载体构建技术的成熟，使抗寒基因转入果树成为可能。CBF是抗寒相关基因COR的转录激活因子，将其导入苹果、葡萄[37]，发现经低温诱导，转化株系叶片中的SOD、POD活性、脯氨酸含量与对照相比均有所提高。在香蕉抗寒基因的研究中，通过农杆菌介导法已经成功将AFP基因导入胚型悬浮细胞系中，现已经获得转基因植株，并且检测呈阳性。通过氮离子注射技术在杏茎段中转入了AFP基因， 研究结果表明， 抗寒生理指标与氮离子束浓度[38]有关。在柑橘的研究上，由筛选到的差异表达cDNA构建差减文库，获得了一个首次在柑橘上发现特有编码冷相关COR413蛋白基因的EST序列，为探明柑橘抗寒的分子机制提供了理论依据。

4抗寒途径研究进展

4.1抗寒育种

减轻寒害的根本途径是抗寒育种。中国果树选种至少已有3 000年以上历史，20世纪50年代初期开始有计划的果树育种，已先后育出苹果、葡萄、梨、杏、柑橘等抗寒新品种40多个，对避免和减少寒害损失起到了重要作用。

4.1.1常规抗寒育种常规抗寒育种途径有杂交育种、芽变选种、实生选种、诱变育种以及砧木育种等。两个耐寒扁桃品种‘晋扁1号和‘晋扁2号是从品种‘ Tuono实生苗中选育出来的，能在-24.3℃低温下安全越冬；‘敖东寒桃[39]为优良抗寒品种，在东北地区适宜栽植，为实生单株选育； “红旗特早玫瑰” 是葡萄新品种，不仅耐寒而且特早熟，为芽变选种育成。据保守统计，我国梨抗寒新品种有28个为杂交育种选育；美国阿肯色州立大学通过杂交选育的葡萄抗寒品种‘信心无核[40]，种植面积遍及美国北部和加拿大，是世界葡萄抗寒育种的一个里程碑。吉林省农业科学院果树研究所选育出抗寒力极强的苹果矮化砧木‘GM256，在生产上得到广泛应用。

4.1.2现代生物技术抗寒育种这种育种方式主要以细胞和基因工程两种技术为手段，以培育抗寒突变体或转基因植株为目的。1983年，世界首例转基因植物——抗病毒烟草在美国问世，如今获得成功的转基因植物己涉及到35科120种。植物抗寒基因工程的研究取得丰硕成果，归纳起来主要有五种途径，即脂肪酸去饱和代谢关键酶基因途径、脯氨酸（Pro）基因途径、糖类代谢基因途径、超氧化物歧化酶（SOD）途径和鱼类抗冻蛋白途径等。沈洪波等[41]以脯氨酸的类似物羟脯氨酸（HYP）为选择压，成功地获得了来自锦橙株心愈伤组织的抗寒植株，经测定其抗寒性比对照增加2.4℃，叶片中几种游离氨基酸含量都比对照增加。万琳深等[14]应用体细胞杂交获得猕猴桃属种间体细胞杂种试管苗， 并分析了它们的抗寒性。植物抗寒基因工程的所用基因，按照物种来源不同分为植物抗寒基因和鱼抗冻蛋白基因两种。果树遗传改良以基因工程为手段是个重要的研究领域，获得转基因植株的果树愈来愈多。

4.2使用药剂提高果树抗寒性

给果树喷施激素是提高果树抗寒力常用的农业措施。作为抗寒基因表达的启动子，激素含量的变化，动态调节着果树抗寒性的产生和提高。目前，广泛用于果树的抗寒诱导激素种类有脱落酸（ABA）、矮壮素（CCC）、比久（B9）、马来酰肼（MH）、多效唑（PP333） 等。胡春霞[42]研究表明，南果梨喷施PP333后越冬枝条中丙二醛含量和相对电导率比对照显著降低，脯氨酸和可溶性糖含量比对照显著增加，这些都表明南果梨抗寒性得到加强。endprint

5展望

果树抗寒研究今后需要加强的工作主要有：（1）优良抗寒基因的寻找、鉴定和克隆；（2）多种果树种类和品种转化体系的构建；（3）培育能够同时抵抗多种逆境的转基因果树，因为果树受到致命伤害常是多种不良环境共同影响所致；（4）深入研究激素在抗寒基因表达中的作用，用以指导生产上利用化控技术增强果树抗寒性；（5）在现有基础上深入研究蛋白质等大分子物质与抗寒性关系；钙信号基因和核酸调控表达机理，尚需更全面系统地研究，且要在更多果树树种和品种上进行推广。

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