洋葱Ms位点多重PCR标记的开发与优化

王振宝+霍雨猛+刘冰江+缪军+杨妍妍+高莉敏+孔素萍+程斐+陈宁+吴雄

摘要：以本课题组已获得的洋葱Ms位点侧翼序列为基础，设计、筛选引物获得了一个兼容的多重PCR分子标记，并对其反应体系和反应程序进行了优化。优化后的扩增体系：10×PCR buffer （Mg2+ free） 2.5 μL、25 mmol/L MgCl2 4 μL、2.5 mmol/L dNTP 6 μL、DNA模板1 μL （约50 ng）、10 μmol/L引物各1 μL、5 U/μL rTaq聚合酶0.6 μL、用灭菌双蒸水补齐至25 μL；反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，65.4℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环；最后72℃延伸10 min。优化后的体系和程序可以检测到清晰的目的条带，通过一次PCR反应即可鉴定Ms位点的3种基因型（MsMs、Msms、msms），操作简单，稳定性好。

关键词：洋葱；雄性不育；Ms位点；多重PCR标记

中图分类号：S633.203.6文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）09-0007-05

洋葱（Allium cepa L.）为两年生二倍体（2n=2x=16）蔬菜植物，广泛种植于世界各地。于近代传入我国，适应性强，耐贮藏和运输，具有广泛的生物活性和重要的药用价值[1]，发展迅速。

洋葱是世界上最早利用雄性不育选育杂交种的蔬菜作物之一，其雄性不育根据细胞质的类型可分为S型和T型。在S型雄性不育系统中，不育性是由单个核基因和细胞质基因共同控制，并且不育性状可被显性核基因（Ms）恢复。在洋葱细胞质育性鉴定上，国内外多个研究团队已成功开发出了几种鉴定细胞质类型的分子标记[2～6]，这些分子标记能够使育种者在几小时内鉴定洋葱细胞质的类型，不需要进行4～8年的测交验证。在洋葱育性恢复基因研究上，由于洋葱基因组DNA巨大（17.9 pg，15 290 Mbp/C）[7]，是玉米基因组的6倍、番茄的16倍、拟南芥的107倍[8]，国内外研究进展缓慢，所开发的分子标记均具有各自的优缺点[9～12]，很难应用于多样性遗传背景亲本材料基因型的鉴定，也无法满足育种过程高通量筛选的需要。

山东省农业科学院蔬菜花卉研究所葱姜蒜研究中心于2013年开发了两个分别与显性Ms和隐性ms等位基因共分离的SCAR标记，分别为DNF-566和RNS-357[13]。这两个标记已通过2个BC1群体、29个育种系和7个杂交种的验证，所鉴定的基因型与表型完全一致。但这两个标记需要两次PCR检测，才可确定Ms位点的基因型。

本试验在前期研究的基础上[13]，拟筛选出洋葱Ms位点兼容的多重PCR分子标记，然后进行扩增体系和程序的优化，开发通过一次PCR试验即可鉴定洋葱Ms位点基因型（MsMs、Msms、msms）的PCR检测系统，进而用于洋葱雄性不育系及保持系的选育，加速洋葱育种系及杂交种选育进程，提高选育效率。

1材料与方法

1.1供试材料

洋葱新鲜叶片采自山东省农业科学院蔬菜花卉研究所试验基地，取样后迅速放入液氮中冷冻，于-80℃保存备用。验证标记所用群体为回交群体[118 ×（118×12-12）]，118为雄性不育系，12-12为对应恢复系。

1.2基因组总DNA的提取

洋葱基因组总DNA的提取采用快捷型植物基因组DNA提取试剂盒（天根生物，北京），方法参照操作说明书。

1.3引物设计

本研究所用引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。UM1、DM1、UM2、DM2为根据Ms侧翼序列设计的引物，Um1、Dm1、Um2、Dm2为根据ms侧翼序列设计的引物（表1）。设计引物时确保引物的3′端为多态性位点。

1.4引物组合

显性Ms位点侧翼序列2对引物（UM1、DM1和UM2、DM2）与隐性ms位点侧翼序列2对引物（Um1、Dm1和Um2、Dm2）分别组合（表2），先在标准体系下对MsMs、Msms、msms 3种基因型单株进行PCR扩增，选择能扩增出目的单倍型的引物组合进行反应体系的优化。

1.5试验设计

1.5.1标准的PCR体系及程序PCR反应总体积为25 μL，其中基因组DNA 1 μL（约50 ng），10×PCR buffer（Mg2+ free）2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 1.5 μL（终浓度为1.5 mmol/L），2.5 mmol/L dNTP 3 μL（终浓度为0.3 mmol/L），4条10 μmol/L引物均为1 μL（终浓度为0.4 μmol/L），5 U/μL rTaq 0.2 μL（终用量为1 U），用灭菌双蒸水补齐至25 μL。扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环；最后72℃保温10 min，4℃保存。PCR扩增产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳分离，在凝胶成像系统上拍照记录。

1.5.2多重PCR反应体系及程序的优化在标准反应体系及程序的基础上，先后对Mg2+浓度、dNTP浓度及冻融次数、最佳退火温度、DNA聚合酶及模板DNA的用量进行了优化。

2结果与分析

2.1不同引物组合的筛选

两对显性Ms等位基因特异性引物与两对隐性ms等位基因特异性引物分别组合，共获得4个组合（表2）。4个引物组合在标准体系下，扩增MsMs、Msms、msms 3种基因型的洋葱，结果（图1）表明，只有引物UM2、DM2与Um2、Dm2的组合（即多重PCR标记MK4）在3种不同基因型材料中都扩增出了特征带（Ms：905 bp，ms：661 bp），MK1和MK2几乎没有Ms的特征条带，MK3在Msms基因型材料中Ms特征条带扩增效率低。因此，选择MK4进行PCR反应体系的优化。endprint

2.2Mg2+浓度对PCR扩增结果的影响

Mg2+是Taq酶活性所必需的，浓度过低时，Taq酶活性显著下降，无特异条带或特异条带扩增不明显，浓度升高时，Taq酶活性增强，扩增效率提高。随着Mg2+浓度的增加，在接近一定数值时，由于出现高盐抑制现象，扩增条带亮度减弱。本研究设计了8个Mg2+终浓度梯度，分别为1、2、3、4、5、6、7、8 mmol/L，由图2可以看出，Mg2+浓度在3～6 mmol/L时，扩增的目的条带均较清晰，因此后续试验采用4 mmol/L MgCl2。

2.3dNTP浓度及冻融次数对PCR扩增结果的影响

dNTP是PCR扩增反应的原料，其浓度是影响PCR扩增结果的重要因素，并且其冻融次数对多重PCR的扩增有较明显的影响。在优化得到4 mmol/L Mg2+浓度下，设置两个dNTP终浓度（0.3、0.6 mmol/L），同时对dNTP母液的冻融次数进行检测。结果（图3）表明，在1～2次冻融次数（1T～2T）下，均可检测到清晰明亮的扩增产物，随着冻融次数的增加（3～4次，3T～4T），扩增效率逐渐降低。在较低的dNTP浓度下，这种现象更加明显。高浓度的dNTP在一定程度上可以弥补因冻融次数增加而造成的PCR扩增效率降低的现象。为确保检测体系的稳定性，选用0.6 mmol/L dNTP用于后续试验。

2.4退火温度对多重PCR扩增结果的影响

退火温度是影响PCR反应的重要条件之一，同时它也具有相对的灵活性。在优化得到的4 mmol/L Mg2+和0.6 mmol/L dNTP浓度条件下，对PCR扩增反应的退火温度进行优化，在55℃到68℃之间共设了8个温度梯度。结果（图4）表明，较低的退火温度不会影响PCR反应，当温度超过65.4℃，隐性ms等位基因扩增效率逐渐降低，当温度达到68.0℃时，无扩增，而显性Ms等位基因仍存在有效扩增。为确保显性和隐性等位基因都能够产生高特异性的有效扩增，退火温度选择65.4℃。

2.5DNA聚合酶的量对PCR扩增结果的影响

在上述优化结果的基础上进行rTaq DNA聚合酶加入量的优化，共设置了8个rTaq梯度，分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 U。结果表明，在设定的范围内，均可以扩增出目的条带，随着rTaq DNA聚合酶加入量的增加，PCR扩增效率逐渐增强（图5）。为了兼顾扩增结果的准确性和试验成本，选择3.0 U rTaq聚合酶进行后续试验。

2.6模板DNA的加入量对PCR结果的影响

对于一个稳定的PCR扩增体系，DNA模板的浓度在一定范围内并不是影响扩增条带强弱的主要因素，因此本研究在1 μL DNA模板（约50 ng）浓度下，先确定主要影响因素，然后设计了7个模板梯度，分别为：0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μL，同时以水为阴性对照（CK）。结果表明，模板浓度较低时，扩增效率较低，随着模板浓度的增加，扩增效率越来越高，在设定的模板浓度梯度范围内，未对PCR反应造成抑制（图6）。因此，选择1.0 μL模板DNA加入量进行PCR扩增。

2.7优化后的体系和程序

通过对扩增体系及反应程序的优化建立了显性Ms和隐性ms等位基因的多重PCR分子标记（MK4）检测系统。25 μL PCR扩增体系包括2.5 μL 10×PCR buffer（Mg2+ free），4 μL 25 mmol/L的MgCl2 （终浓度为4 mmol/L）、6 μL 2.5 mmol/L的dNTP（终浓度为0.6 mmol/L）、DNA模板1 μL （约50 ng）、10 μmol/L的引物各1 μL（终浓度为0.4 μmol/L）、5 U/μL rTaq聚合酶0.6 μL（终用量为3 U），用灭菌双蒸水补齐至25 μL，退火温度为65.4℃，35个循环。对MsMs、Msms、msms 3种基因型洋葱育种系进行扩增（图7），结果表明，3种基因型的材料，均得到了清晰可见的目的条带，扩增结果与基因型完全相符。

为了验证开发优化的MK4标记，对239株BC1分离群体进行单株检测。结果表明，所有的可育单株均可扩增出905、661 bp两条带，而所有不育单株均只扩增出661 bp条带（图8），标记检测结果与表型完全相符。因此，确定开发的MK4标记能够用于田间材料的鉴定。

3结论与讨论

本研究通过引物筛选、体系和程序优化获得了一个可同时检测显性Ms和隐性ms等位基因的多重PCR分子标记MK4（UM2、DM2、Um2、Dm2）；PCR扩增体系为10×PCR buffer（Mg2+ free）2.5 μL，25 mmol/L的MgCl2 4 μL、2.5 mmol/L的dNTP 6 μL、模板DNA 1 μL（约50 ng）、10 μmol/L引物各1 μL、5 U/μL rTaq聚合酶0.6 μL，用灭菌双蒸水补齐至25 μL；扩增程序为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，65.4℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环；最后72℃延伸10 min。该分子标记系统可以通过一次PCR试验鉴定3种Ms座位基因型（MsMs、Msms、msms）的洋葱材料，扩增结果与基因型完全相符。

多重PCR反应体系和程序与普通PCR极为类似，除了考虑各组分间的比例及退火温度外，还应首先考虑多重PCR引物间的兼容性，引物的兼容性不好，就会造成扩增效率极低甚至无扩增，无法检出相关的等位基因；第二，应该特别注意dNTP的冻融次数，随着冻融次数的增加，扩增效率降低，然而高浓度dNTP可以部分抵消因冻融次数造成的扩增效率降低的现象；第三，本研究未对引物浓度进行优化，原因为终浓度为0.4 μmol/L时，两个等位基因在表观上的检测亮度基本相似，未出现扩增严重不平衡的现象。但在其它多重PCR的开发和应用中，可以通过调整待检测位点的引物浓度，调节扩增条带的亮度，进而达到便于鉴定识别的目的。endprint

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