中心组合设计-响应曲面法优化淫羊藿苷超声波提取工艺

侯莹莹，赵 岩，唐国胜，郭 帅，韩玲玲，李学军，张志东，杨 鹤，刘双利，张连学

(1 吉林农业大学 中药材学院，吉林 长春 130118；2 康美新开河(吉林)药业有限公司，吉林 集安 134200)

中心组合设计-响应曲面法优化淫羊藿苷超声波提取工艺

侯莹莹1，赵 岩1，唐国胜1，郭 帅1，韩玲玲1，李学军2，张志东2，杨 鹤1，刘双利1，张连学1

(1 吉林农业大学 中药材学院，吉林 长春 130118；2 康美新开河(吉林)药业有限公司，吉林 集安 134200)

【目的】 采用中心组合设计-响应面法优化淫羊藿苷的超声波提取工艺。【方法】 在单因素试验的基础上采用中心组合设计方法，研究了乙醇用量、超声提取时间、液(mL)固(g)比及其交互作用对淫羊藿苷提取率的影响。【结果】 通过岭脊分析确定的淫羊藿苷最优提取条件为：乙醇体积分数68%、超声提取时间23 min、液(mL)固(g)比32∶1， 该条件下淫羊藿苷的提取率可达到0.661%，与理论值0.663%十分接近。【结论】 确定了淫羊藿苷的最佳提取工艺，该工艺具有耗时短、提取率高、能量消耗少且工艺稳定可靠等优点。

淫羊藿；淫羊藿苷；提取工艺；中心组合设计；响应面分析

淫羊藿(Epimediumbrevicornumaxim)又称仙灵脾，为小檗科(Berberidaceae) 淫羊藿属(Epimedium)多年生草本植物，在中国已有2 000多年的药用历史[1]，主要分布在中国的黑龙江、吉林、辽宁、山东、江西等地[2]。淫羊藿中的主要活性成分是以淫羊藿苷为代表的黄酮苷类化合物，淫羊藿苷具有改善心脑血管功能、促进性腺功能、增强机体免疫力、延缓衰老、抗肿瘤等生理活性[3-12]。

目前，关于淫羊藿苷的提取工艺已有一些相关报道[13-16]，试验多采用均匀设计法和正交实验法，但这2种方法均存在一定的不足。均匀设计法的目的是在尽量减少实验次数的同时尽可能多地考察实验因素，再加上可能要引入某些因素的平方项或交叉乘积项作为派生的“自变量”，会导致自变量个数太多，而使获得的多重线性回归方程不唯一，同时不同的研究结果彼此之间可能会相差悬殊。正交实验当试验需考察的因素较多并且每个因素都有多个水平时，为了照顾整齐可比，试验就无法充分地均匀分散，并且试验的次数会很多(试验次数随水平数的平方而增加)，从而导致试验难以安排。响应面分析法是基于合理的试验设计，利用试验得到的相关数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，是解决多变量问题的一种重要的统计方法[17-18]，它具有试验次数少，试验精度高等特点，在药学上应用成效显著。本研究采用中心组合设计-响应面法优化了淫羊藿苷的超声提取工艺，以期为淫羊藿苷的提取提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 淫羊藿苷 淫羊藿苷购于上海莱雀生物科技有限公司，纯度大于98%。

1.1.2 淫羊藿 淫羊藿采收于吉林省临江市，经吉林农业大学张连学教授鉴定为淫羊藿(Epimediumbrevicornumaxim)，试验前筛选去梗、去茎、晒干，粉碎过孔径0.90 mm的筛后，阴凉处保存。

1.1.3 仪器与试剂 CXTH-3000高效液相色谱仪(北京创新通恒科技有限公司)；DHG-9140A型恒温干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；KQ-250B型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；ABS 320-4N型分析天平(上海岛韩实业有限公司)；酒精计(河北省沧县杜生热工仪表厂)。乙腈，色谱纯；其他试剂均为分析纯；试验用水为超纯水。

1.2 淫羊藿苷标准曲线的建立

用甲醇精确配制0.3 μmol/mL的淫羊藿苷标准液，备用。精密吸取淫羊藿苷标准液0.01，0.05，0.10，0.50和1.00 mL，分别用甲醇定容在1 mL容量瓶中，配制成0.003，0.015，0.030，0.150和0.300 μmol/mL的淫羊藿苷标准工作液。取淫羊藿苷标准工作液进行高效液相色谱(HPLC)分析，以淫羊藿苷峰面积为纵坐标(y)，浓度为横坐标(x)，进行线性回归分析，得到的回归方程为y=4E-08x-0.000 8(R2=0.999 6)，说明在0.003～0.300 0 μmol/mL范围内，淫羊藿苷浓度与HPLC峰面积呈良好的线性关系。

HPLC条件：色谱柱为大连江申分离科学技术公司C18(150 mm×4.6 mm，5 μm);流动相乙腈-水(V(乙腈)∶V(水)=25.5∶74.5)；检测波长270 nm；柱温25 ℃；流速1.0 mL/min；进样量20 μL。

1.3 淫羊藿苷的提取及测定

精密称取淫羊藿粉末0.5 g，置于三角瓶中，按一定的液(mL)固(g)比(下文简称液固比)加入不同体积分数的乙醇，按设定时间超声提取，过滤，滤液用尼龙膜再次过滤，取滤液作为供试品溶液。

取0.3 μmol/mL对照品溶液和供试品溶液各20 μL，分别进行HPLC分析，记录色谱图，计算供试品中淫羊藿苷的提取率。

1.4 淫羊藿苷提取工艺的单因素试验

对超声提取的乙醇用量、超声提取时间、液固比分别进行单因素试验，考察这3个因素对淫羊藿苷提取率的影响。

1.4.1 乙醇体积分数的影响 超声提取时间固定为20 min，液固比为40∶1，乙醇体积分数分别为0，20%，40%，60%，80%和95%，试验重复6次。

1.4.2 超声提取时间的影响 固定乙醇体积分数为60%，液固比为40∶1，超声提取时间分别为5，10，20，40，60和80 min，试验重复6次。

1.4.3 液固比的影响 固定乙醇体积分数为60%，超声提取时间为20 min，液固比分别为5∶1，10∶1，20∶1，40∶1，60∶1和80∶1，试验重复6次。

1.5 淫羊藿苷提取工艺的中心组合设计-响应曲面法优化

为了分析各因素及其交互作用对淫羊藿苷提取率的影响，在单因素试验的基础上，以淫羊藿苷提取率为考察目标，进行中心组合试验设计，中心组合设计各因素水平详见表1，中心组合设计见表2，并依据表2进行17次试验。利用SAS软件的RSREG(二次响应面回归模型)程序对试验结果进行响应面分析，用岭脊分析优化试验工艺，采用ORIGIN软件绘制响应面曲面图。

表1 淫羊藿苷提取工艺中心组合设计的因素与水平Table 1 Factors and levels of central composite design for the extraction process of the icariin

2 结果与分析

2.1 淫羊藿苷提取工艺的单因素试验结果

2.1.1 乙醇体积分数对淫羊藿苷提取率的影响 由图1可知，当乙醇体积分数低于60%时，随着其用量的升高，淫羊藿苷提取率增加；但当乙醇体积分数高于60%时，随着乙醇用量的升高，淫羊藿苷的提取率反而降低。考虑到实际生产，乙醇回收的耗能问题，应尽可能选择高含量乙醇进行提取，因此乙醇体积分数以20%～95%为佳。

2.1.2 超声提取时间对淫羊藿苷提取率的影响 由图2可知，整体趋势上，随着超声提取时间的延长，样品中淫羊藿苷的提取率也随之提高。超声提取时间在5～20 min，提取率增加相对缓慢；在20～40 min，提取率增加较快，在40～80 min，提取率增加缓慢。考虑到实际生产中的耗能等问题，在保证提取率的前提下，应尽可能选择较短的超声时间，故超声提取时间以5～40 min为宜。

2.1.3 液固比对淫羊藿苷提取率的影响 由图3可

知，液固比在(5∶1)～(10∶1)时，淫羊藿苷提取率增加缓慢；在(10∶1)～(40∶1)时，淫羊藿苷提取率增加幅度较大；在(40∶1)～(60∶1)时，提取率增加缓慢；液固比大于60∶1时，提取率有降低的趋势。考虑到实际生产中的溶剂回收问题，应尽量选择较小的液固比，故液固比考察范围以(10∶1)～(60∶1)为宜。

图1 乙醇体积分数对淫羊藿苷提取率的影响

图2 超声提取时间对淫羊藿苷提取率的影响Fig.2 Effects of ultrasonic extraction time on extraction rate of icariin

图3 液(mL)固(g)比对淫羊藿苷提取率的影响Fig.3 Effects of liquid-solid ratio on extraction rate of icariin

2.2 淫羊藿苷提取工艺的中心组合设计-响应面分析

2.2.1 试验方案及结果 淫羊藿苷提取工艺中心组合设计试验结果见表2。

表2 淫羊藿苷提取工艺中心组合试验设计与结果Table 2 Arrangement and results of central composite design for the extraction process of icariin

表3 淫羊藿苷提取率回归模型系数的显著性检验Table 3 Significance of regression coefficients for the extraction data icariin

注：*表示显著(P<0.05)， **表示极显著(P<0.01)；在P<0.2水平上拒绝假设。

Note:*Indicatessignificantdifference(P<0.05),**Indicatesextremelysignificantdifference(P<0.01);AtP<0.2level,hypothesiswasrejected.

表4 淫羊藿苷提取率回归模型的方差分析Table 4 Analysis of variance of regression equations for the extraction data of icariin

注：**表示极显著(P<0.01)。

Note:**Indicatesextremelysignificantdifference(P<0.01).

从表4可以看出，总模型、线性项、平方项的P<0.001，表明总模型和方程的线性项、平方项对淫羊藿苷提取率的影响极显著；而方程的交互项的P>0.05，表明其对提取率的影响不显著。相关性分析中，总模型的复相关系数R2=0.957 4，表明回归方程对淫羊藿苷提取率的预测值与实测值有较好的相关性。失拟性检验分析结果显示P=0.058>0.05，表明失拟性不显著，该回归方程无失拟因素存在，回归方程与实测值能较好地拟合。

表5 淫羊藿苷提取率模型的岭脊回归分析Table 5 Ridge analysis of maximum responses for the extraction data of icariin

根据回归分析结果，运用ORIGIN软件绘制响应曲面图，即淫羊藿苷提取率y与乙醇体积分数x1、超声提取时间x2、液固比x3构成的三维空间图形。为了更直观地表现2个因素同时对淫羊藿苷提取率的影响，可以令第3个因素水平值在中心点(即编码水平为0)，仅考虑该2个因素对提取率的影响,结果见图4～6。由图4～6可知，3个响应面图形均开口向下，可以直观地得出淫羊藿苷提取率的较优提取工艺条件为：x160%～70%、x215～25min、x3(25∶1)～(35∶1) 。

由岭脊分析结果(表5)可知，回归方程预测的淫羊藿苷的最佳提取条件为：乙醇体积分数68%、超声提取时间为23min、液固比为32∶1。为验证模型的有效性，在上述条件下，进行3次重复性试验，结果淫羊藿苷提取率分别为0.671%，0.665%和0.647%，平均值为0.661%，试验值与预测值拟合良好，也进一步说明了模型的可行性。

图4 乙醇体积分数为57.5%时超声提取时间和液(mL)固(g)比对淫羊藿苷提取率的影响

图5 超声提取时间为22.5 min时乙醇体积分数和液(mL)固(g)比对淫羊藿苷提取率的影响Fig.5 Responsive surface plot for ethanol concentration and liquid to solid ratio of icariin (Fixed ultrasonic extraction time=22.5 min)

图6 液固比为35∶1时乙醇体积分数和超声提取时间对淫羊藿苷提取率的影响Fig.6 Responsive surface plot for ethanol concentration and ultrasonic extraction time of icariin (Fixed liquid to solid ratio=35∶1)

3 讨论与结论

本试验选择超声提取法提取淫羊藿苷，考察对象为乙醇用量、超声时间、液固比3个影响因素，采用中心组合试验设计对单因素及其相互作用进行探讨，并通过中心组合设计-响应面分析方法，建立了超声辅助提取淫羊藿苷的数学模型，回归方程的复相关系数为0.957 4，方程拟合良好。通过岭脊分析优化出超声波提取淫羊藿苷的最佳工艺参数为：乙醇体积分数68%、超声提取时间23min、液固比 32∶1。

目前，淫羊藿苷的提取大多数研究都选用均匀设计和正交试验设计的方法进行实验[13-16,19-20]，虽然这2种方法基本可以满足一般试验的要求，但还存在一些问题，如试验的精度不够，无法精确找到最佳条件。如贾恒明等[19]采用正交设计优选淫羊藿苷提取工艺，确定的最佳条件为：用水浸泡12h，用8倍量的70%乙醇热回流提取2次,1.5h/次, 与本试验确定的工艺相比存在操作较繁琐、提取时间相对较长、耗能较多等不足。

综上可知，本试验通过中心组合设计-响应曲面法确定的淫羊藿苷超声波提取工艺，具有提取效率高、时间短、耗能少等优点，并且采用的方法为纯物理方法，保证了化学成分的稳定，这为淫羊藿苷简便、高效的工业化大规模生产提供了可能，也为深入研究淫羊藿苷的药理功能及促进淫羊藿药材的有效利用奠定了基础。

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Optimization of icariin extraction fromEpimediumbrevicornumaximby supersonic wave using central composite design and response surface methodology

HOU Ying-ying1,ZHAO Yan1,TANG Guo-sheng1,GUO Shuai1,HAN Ling-ling1,LI Xue-jun2,ZHANG Zhi-dong2,YANG He1,LIU Shuang-li1,ZHANG Lian-xue1

(1CollegeofChineseMedicinalMaterials,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China;2KangmeiXinkaihe(Jilin)PharmaceuticalCompanyLimited,Ji’an,Jilin134200,China)

【Objective】 The ultrasound-assisted extraction of icariin fromEpimediumbrevicornuMaximwas optimized using response surface methodology and central composite design (CCD).【Method】 Based on single factor tests,the effects of ethanol concentration,ultrasonic extraction time,liquid to solid ratio and their interactions on extraction rate were studied using CCD method.【Result】 The optimal ultrasonic extraction conditions based on ridge analysis were:ethanol concentration 68%,ultrasonic extraction time 23 min,liquid to solid ratio 32 mL/g.Under the optimum conditions,the extraction yield of total icariin was 0.661%,which was close to the theoretical value of 0.663%.【Conclusion】 The optimal extraction conditions of epimedium glycoside extraction were determined and the advantages included short time,high extraction efficiency,less energy consumption,stable,and reliable.

Epimediumbrevicornumaxim;icariin;extraction technique;central composite design;response surface analysis

时间:2015-09-09 15:41

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.10.024

2014-01-20

国家科技支撑计划项目(2011BAI03B01)；国家公益性行业科研专项(201303111)；吉林省科技发展计划项目(20126046)；吉林省中医药产业发展专项(YYZX201258)

侯莹莹(1990-)，女，吉林吉林人，硕士，主要从事天然药物化学成分提取与生物活性研究。E-mail：zmlhyy@126.com

赵 岩(1979-)，男，吉林长春人，副教授，博士，主要从事天然药物化学成分提取与生物活性研究。 E-mail：zhyjlu79@163.com

R284.2

A

1671-9387(2015)10-0175-07

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150909.1541.048.html